§ 10. Хроматография, ее сущность и применение в биологии и медицине
Одна из важных задач современной химии – надежный и точный анализ органических веществ, часто близких по строению и свойствам. Без этого невозможно проведение химических, биохимических и медицинских исследований. На этом в значительной степени базируются экологические методы анализа окружающей среды, криминалистическая экспертиза, а также химическая, нефтяная, газовая, пищевая, медицинская отрасли промышленности и многие другие отрасли экономики.
Один из наиболее чувствительных методов – хроматографический анализ, впервые предложенный российским ботаником М.С. Цветом в начале ХХ века и к концу века превратившийся в мощнейший инструмент, без которого не обходятся и медики. Пропуская раствор хлорофилла через колонку с адсорбентом (оксид алюминия) М.С. Цвет установил, что различные компоненты сложного раствора адсорбируются на разном уровне высоты колонки. После нескольких циклов промывания растворителем, в колонке обнаруживаются расположенные одна над другой по-разному окрашенные зоны, располагающиеся сверху вниз в порядке уменьшения адсорбционной способности. В соответствии с этим, разделение веществ в результате сорбционных процессов при направленном движении одной из фаз назвали хроматографией. Хроматография в переводе с греческого означает цветописание (хромос – цвет, графо – пишу), хотя сам М.С. Цвет указывал на возможность разделения этим методом и бесцветных веществ. Этот метод анализа называется хроматографическим разделением. Колонка с твердым адсорбентом называется хроматографической колонкой, а само распределение в колонке по-разному окрашенных компонентов – хроматограммой.
Метод хроматографии и различные методы разделения и определения компонентов сложных смесей основаны на явлении адсорбции. Хроматография – это физико-химический метод, основанный на способности адсорбента избирательно и последовательно поглощать растворенные вещества. Суть ее заключается в том, что отдельные компоненты смеси по-разному удерживаются веществом – адсорбентом, способным избирательно поглощать те или иные молекулы или ионы. Особенностью данного метода является возможность разделения сложных смесей на составные части без изменения химического состава веществ, составляющих эти смеси. В этом методе разделения компоненты подвижной фазы (смеси газов, раствора) двигаются относительно другой неподвижной фазы (слоя сорбента). При фильтрации, например, раствора смеси веществ, через колонку адсорбента растворенные вещества адсорбируются послойно в порядке уменьшения адсорбируемости: в верхней части колонки – хорошо адсорбирующиеся, в нижней – менее поглощаемые данным адсорбентом (рис. 16). По высоте колонки образуются различные цветные зоны. Из каждой адсорбционной зоны компоненты выделяются соответствующей обработкой. Чем толще слой адсорбента, тем лучше будет идти разделение.
Рис. 16. Хроматографическая колонка:
1 – уровень жидкости (минимум); 2 – песок;
3 – Al2O3; 4 – стеклянная вата; 5 – зажим
Так как на одном и том же адсорбенте различные вещества адсорбируются по-разному, то разделение в хроматографическом методе определяется природой адсорбируемых веществ и природой адсорбента.
Хроматографические методы различаются по следующим признакам:
– по механизму разделения – молекулярно-адсорбционная, распределительная, ионообменная, осадочная хроматография и гель-фильтрация;
– по агрегатному состоянию системы, в которой проводится разделение смеси на компоненты – газовая, жидкостная и газо-жидкостная хроматография;
– по методике проведения – колоночная, капиллярная, плоскостная (тонкослойная хроматография и хроматография на бумаге);
– по способу передвижения компонентов смеси вдоль неподвижной фазы – проявительная, вытеснительная и фронтальная.
Наиболее часто используют газовую и жидкостную хроматографии, которые именуются таким образом в зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы. Если подвижной фазой является газ, то такую хроматографию называют газовой, если же подвижная фаза жидкость – жидкостной. С помощью газовой хроматографии обычно разделяют летучие вещества с молекулярной массой до 300, и термически стойкие соединения, с помощью жидкостной – разделяют нелетучие вещества с молекулярной массой от 300 до 2000, неорганические ионы и термически нестойкие соединения. В свою очередь, газовая хроматография подразделяется на газо-адсорбционную (неподвижная фаза – твердый адсорбент) и газо-жидкостную (распределительную) хроматографию. В этом случае поры твердого инертного носителя заполняют жидкостью, и при распределении происходит абсорбция газа жидкостью. А жидкостная хроматография подразделяется на жидкостно-адсорбционную (неподвижная фаза – твердый адсорбент) и жидкостно-жидкостную, когда обе фазы жидкие.
Достоинствами хроматографического метода являются его универсальность, так как с его помощью разделяются практически любые вещества; обеспечение высокой степени разделения, которую можно регулировать; позволяет разделять даже микроколичества вещества; быстрота проведения анализа и его надежность.
С помощью метода хроматографии можно изучать термодинамику адсорбционных процессов, определять коэффициенты диффузии, удельные поверхности адсорбентов, катализаторов, молекулярные массы веществ. Он позволяет разделять сложные смеси биологических веществ на отдельные компоненты, производить очистку растворов биополимеров от примесей, концентрирование биологических веществ из сильно разбавленных растворов, качественный и количественный анализ исследуемого вещества.
В биологии и медицине широко применяют ионообменную хроматографию для разделения и определения белков, аминокислот в тканевых экстрактах, физиологических жидкостях и т.д. Для ионообменной хроматографии белков и других биологических веществ применяются синтетические иониты на целлюлозной основе – целлюлозо-иониты (анионит – диэтиламиноэтилцеллюлоза ДЭАЭЦ и катионит – карбоксиметилцеллюлоза КМЦ).
В настоящее время иониты в медицине используют для выявления некоторых вирусов, для связывания в желудочно-кишечном тракте ядовитых веществ и токсинов, для диагностики острых и хронических заболеваний печени и т. п. Печень участвует в белковом обмене и регуляции в поддержании постоянства аминокислотного состава плазмы. Поэтому при различных заболеваниях печени наблюдается изменение содержания отдельных свободных аминокислот. Анализ аминокислот с помощью ионообменной хроматографии позволяет быстро ставить диагноз и правильно применять методику лечения больных. Так, повышение содержания цистина, аспарагиновой и глутаминовой кислот и снижение количества лизина указывает на заболевание вирусным гепатитом. Иониты и различные сорбенты применяются в аппарате «Искусственная почка» (АИП). В фармакологии хроматографические методы позволяют разделять и очищать различные лекарственные вещества, витамины, гормоны, аминокислоты, вируссодержащие материалы для препаративного получения очищенного вируса гриппа. Хроматографические методы позволяют определять содержание различных элементов и веществ в пищевых продуктах, кормах и окружающей среде. Например, с помощью ионообменной хроматографии можно обнаружить следы меди в молоке, зернах пшеницы и вине, свинца в сахарных сиропах, ртути в семенах огурцов и т. п. Хроматография используется для деминерализации воды и очистки сточных вод, для качественного и количественного анализа многих смесей веществ, включая определение загрязнителей окружающей среды (вредных газов и паров, токсических веществ, пестицидов и др.).