Оптимизация транскрипционных элементов

Важным компонентом ДНК-вакцины является промотор. Бактериальные промоторы не подходят для экспрессии антигена в клетках млекопитающих, поэтому вместо них использовали промоторы онкогенных вирусов. Сейчас, для повышения безопасности вакцин, их заменили на промоторы от неканцерогенных объектов, например, человеческого цитомегаловируса(CMV). Для большинства ДНК-вакцин этот промотор является оптимальным выбором: он характеризуется высокой экспрессией в широком диапазоне клеток. Для экспрессии гена в конкретных тканях, перспективным является использование промоторов, специфических для данного типа тканей. Например, использование промотора мышечнойкреатинкиназы при внутримышечном введении приводит к десятикратному увеличению синтеза антител и индукции Т-клеточного ответа, чем использование аналогичной ДНК-вакцины с CMV промотором. Также высокую эффективность вмиоцитах показал промотор гена десмина, который кодирует один из белков цитоскелета. Для повышения экспрессии ДНК-вакцины в кератиноцитах (клетки эпителиальной ткани) используют промоторы гена металлотионеина (белок, который связывает тяжёлые металлы) или гена гидроксилазы витамина D3.

Уровень инициации транскрипции, как правило, повышается за счёт использования сильного промотора и энхансеров, а особенности терминации могут стать ограничивающим фактором. Эффективность полиаденилирования и процессингапервичного РНК-транскрипта меняется в зависимости от последовательности polyA-сигнала. То есть, последовательность полиаденилирования влияет на синтез антигена. Например, широко используемый polyA-сигнал вируса SV40 имеет меньшую эффективность, чем сигнал полиаденилирования гена β-глобина кролика или гена гормона роста быка.

Для эффективной трансляции мРНК млекопитающих должна иметь так называемую последовательность Козак. Вставка этой последовательности в ДНК-конструкцию может существенно увеличивать уровень синтеза антигена. Чтобы РНК-полимераза не проскочила стоп-кодон гена и не состоялся синтез удлинённого протеина, который не сможет потом получить правильную укладку, ген можно заканчивать двойным стоп-кодоном^[36].

При конструировании ДНК-вакцины также пытаются оптимизировать её кодоны. Процедура оптимизации означает замену границ в последовательности гена таким образом, чтобы аминокислотная последовательность белка не менялась, но увеличивалась эффективность трансляции его мРНК. Причиной является то, что большинство аминокислот кодируются более чем одним кодоном. Каждый кодон имеет свою тРНК, и представленность различных тРНК в клетке неодинакова, причём она также варьирует в зависимости от вида организма. Кодоны подбирают таким образом, чтобы наличие нужной тРНК при синтезе антигена не стало лимитирующим фактором.

Оптимизация антигена

Хотя сила иммунного ответа коррелирует с уровнем экспрессии ДНК-вакцины, однако для каждого антигена существует определённое плато, после которого увеличение количества антигенного протеина не будет повышать продукцию антител. В то же время, достичь более сильной иммунной реакции можно за счёт оптимизации антигена. Например, путём объединения антигена с лигандом до определённого рецептора антигенпредставляющей клетки (АПК). Таким лигандом может быть маркерный белок CD40, внеклеточный домен Fms-подобной тирозинкиназы-3 или антиген-4 Т-киллеров. За счёт взаимодействия лиганд-рецептор повышается эффективность захвата антигенного протеина АПК.

Облегчение деградации антигена в протеасоме или лизосоме также будет стимулировать иммунную реакцию. Для усиления протелиотического расщепления антигена, в его последовательность встраивают сигнал убиквитинирования^[34]. Использование кодирующих ДНК-вакцин вместо целого антигена, нескольких эпитопов различного происхождения, позволяет значительно расширить спектр иммунного ответа.

Для противоопухолевых ДНК-вакцин эффективной является комбинация «опухолевый антиген + вирусный или бактериальный антиген». Например, сочетание опухолевого антигена с эпитопом токсина столбняка значительно повышает активацию Т-киллеров против раковых клеток.

Включение адъювантов

При применении традиционных вакцин для повышения иммунного ответа к ним добавляют адъюванты. ДНК-вакцина имеет бактериальное происхождение, поэтому она сама является иммуностимулятором. Для усиления иммунного ответа в ДНК-вакцину встраивают гены адъюванта или применяют дополнительную плазмиду, которая кодирует иммуностимулирующие белки^[41].

Иммуностимулирующее действие бактериальных CpG динуклеотидов

Функция плазмиды не ограничивается доставкой генов в клетки. Еще в 1893 году было обнаружено, что смесь бактериальных лизатов уменьшает прогрессирование раковых опухолей, однако лишь в 1983 установили, что иммуностимулирующие свойства лизата обусловлены молекулами ДНК бактерии^[42]. В 1995 году показали, что стимуляция иммунитета вызвана CpG-мотивами бактериальной ДНК. У бактерий, а также ДНК-вирусов, эти мотивы являютсянеметилированными. В организме человека и высших приматов, наоборот, цитозин в составе большинства CpG-динуклеотидов содержит метильную группу. Поэтому неметилированные CpG-мотивы воспринимаются человеческим организмом как патагенассоциированные молекулярные паттерны (ПАМП) (PAMP, pathogen-associated molecular patterns). ПАМП-соединения распознаются толл-подобными рецепторами, которых, в зависимости от типа лиганда, разделяют на несколько типов. Неметилированные CpG-мотивы распознаёт рецептор TLR-9, расположенный на мембранахэндоплазматического ретикулума В-лимфоцитов, дендритных клеток и натуральных киллеров. Связывание рецептора с неметилированными CpG-мотивами запускает каскад реакций, в результате которого индуцируется синтез провоспалительных цитокинов — интерферона-1 и IL-12.