3. Получение генов с помощью рестриктаз.

Рестриктазы – это ферменты, узнающие определенные последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК (сайты рестрикции) и разрезающие молекулу в этих точках. Сайты рестрикции – палиндромные последовательности, специфичные для каждого вида рестриктазы. Разрезание приводит к появлению липких или тупых концевых фрагментов ДНК.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) К. Мюллис, 1980.

Метод используется для увеличения числа выделенных или синтезированных генов: это быстрая репликация фрагментов ДНК (амплификация) invitro.

Для реакции необходимо:

• Tag – ДНК – полимераза.

• среда со свободными нуклеотидами (А, Т, Г, Ц).

• праймеры ДНК.

• амплификатор.

Стадии ПЦР:

1. Денатурация - +90ºС, 15 сек. Образуются одноцепочечные фрагменты инкубируемой ДНК.

2. Гибридизация - +50ºС, 30 сек. Гибридизация цепей ДНКспраймерами.

3. Полимеризация - +70ºС, 90 сек. Tag – ДНК – полимераза удлиняет праймеры до размеров матричных ДНК.

Использовние полученных генов.

1. Промышленное производство БАД.

2. Создание и производство вакцин.

3. Генодиагностика.

4. Генотерапия.

Получение БАД:

• Создание рекомбинантной ДНК (вектора).

• Введение векторной молекулы в клетку.

• Отбор трансформированных клеток с работающим геном.

• Производство БАД.

Вектор – небольшая автономно реплицирующиеся молекула ДНК, обеспечивающая функционирование встроенного в нее гена.

Требования к векторам:

• автономная репликация в клетке.

• стабильноенаследование клеткой – хозяином.

• наличие большого числа копий в клетке.

• достаточная емкость.

• наличие «удобных» сайтов рестрикции.

• наличие селективных маркеров.

Виды векторов:

Плазмиды– небольшие кольцевые ДНК бактерий; используются для переноса генов.

Фаговые векторы – ДНК содержащие бактериофаги: фаг λ, фагМ 13.

Космиды – плазмидные вектора, в которые встроен участок генома фага λ, обеспечивающийвозможностьупаковкиэтоймолекулыДНКвфаговуючастицу.

Фазмиды– являются гибридами между фагом и плазмидой. После встройки чужеродной ДНК могут в одних условиях развиваться как фаги, в других – как плазмиды.

Челночные векторы – способны к репликации в разных клетках – хозяевах: Одни и те же гены получают возможность реплицироваться и экспрессироваться в разных организмах.

Основной вектор для клонирования генов животных – геном вируса – SV40.

Основные векторы для клонирования растений – геномы вирусов растений и плазмидаpTi агробактерий.

Стволовые клетки – это недифференцированные клетки, которые первыми образуются в организме зародыша и дифференцируют в специализированные ткани человеческого организма.

Первое предположение о существовании стволовых клеток было высказано русским ученым Александр Александрович Максимовым (1874 - 1928), выдающейся ученый, один из создателей унитарной теории кроветворения. Максимов А.А. во многим предопределил направление развития мировой науки в области клеточной биологии. Термин «стволовая клетка» Максимов А.А. предложил еще в 1908 году, чтобы объяснить механизм быстрого самообновления клеток крови. Он выступил с новой теорией кроветворения в Берлине на съезде гематологов. Именно этот год можно по праву считать началом истории развития исследований стволовых клеток!

Каждые сутки в крови погибают несколько миллиардов клеток, а им на смену приходят новые популяции эритроцитов, лейкоцитов и лимфоцитов. Максимов А.А. первый догадался, что обновление клеток крови – это особая технология, отличная от простых клеточных делений. Если бы клетки крови самообновлялись простым клеточным делением, это потребовало бы гигантских размеров костного мозга.

Сегодня стволовые клетки – это орган экстренной репарации в случае аварийных, массивных повреждений ткани (травмы, вирусы, химические, тепловые повреждения). В долгосрочном плане стволовые клетки – это аппарат клеточного гомеостаза, основанного на постоянном самообновлении клеток, смены устаревших, отработанных клеток с целью защиты от болезней (накопления аномальных клеток) и преждевременного старения. Стволовые клетки являются исходными при образовании специализированных дифференцированных клеток. Существует иерархия стволовых клеток.

Тотипотентные – стволовые клетки могут далее давать в процессе последовательных превращений множество типов клеток организма. Такими клетками являются эмбриональные стволовые клетки (ЭСК).

Плюрипотентные – стволовые клетки характеризуются способностью давать множество разных типов дифференцированных клеток в определенном типе ткани. К таким клеткам относятся клетки костного мозга.

Унипотентные – стволовые клетки способны образовывать только один тип дифференцированных клеток. Это означает, что они могут давать только строго определенные типы конечных дифференцированных клеток. Стволовые клетки теоретически способны к неограниченному делению. При делении стволовых клеток часть из дочерних клеток остается стволовыми, другая начинает процесс дифференцировки.

Для быстрого восстановления после перенесенной травмы в пожилом возрасте, последствие инсульта и инфаркта, успешно применяются мезенхимальныеаутологичные (собственные) стволовые клетки, которые можно получить различными способами (из перефирической крови, мышечной, жировой ткани, костного мозга). Процедура занимает от 4 дней дот 19-60, в зависимости от метода и необходимости клонирования исходного материала для последующего введения и хранения.

Во взрослом организме стволовые клетки находятся, в основном, в костном мозге и, в очень небольших количествах, во всех органах и тканях. Они обеспечивают восстановление поврежденных участков органов и тканей. Стволовые клетки, получив от регулирующих систем сигналы о какой-либо «неполадке», по кровяному руслу устремляются к пораженному органу. Они восстановить практически любое повреждение, превращаясь на месте в необходимые организму клетки (костные, гладкомышечные, печеночные, сердечной мышцы или даже нервные) и стимулируя внутренние резервы организма к регенерации (восстановлению) органа и ткани.

Запас стволовых клеток взрослого организма очень невелик. Поэтому случается так, что обновить утраченные клетки организм самостоятельно уже не в состоянии: или очаг поражения слишком велик, или организм ослаблен, или возраст уже не тот. Можно ли помочь больному излечиться от цирроза, инсульта, паралича, диабета, ряда заболеваний нервной системы? Уже сегодня в ряде случаев, ученые умеют направлять стволовые клетки «по нужному пути». Достижения в этой области клеточной медицины делают возможности терапевтического использования стволовых клеток практически безграничными.

Генная инженерия оказались очень перспективной для медицины, прежде всего, в создании новых технологий получения физиологически активных белков, используемых в качестве лекарств (инсулин, соматостатин, интерфероны, соматотропин и др.).

Инсулин используют для лечения больных диабетом, который стоит на третьем месте (после болезней сердца и рака) по частоте вызываемых смертельных случаев. Мировая потребность инсулина составляет несколько десятков килограммов. Традиционно его получают из панкреатических желез свиней и коров, но гормоны этих животных слегка отличаются от инсулина человека. Инсулин свиней различается по одной аминокислоте, а коровий – по трем. Считают, что инсулин животных часто вызывает побочные эффекты. Хотя химический синтез инсулина осуществлен давно, но до сих пор промышленное производство гормонов оставалось очень дорогим. Сейчас получают дешевый инсулин с помощью генно-инженерного метода путем химико-ферментативного синтеза гена инсулина с последующим введением этого гена в кишечную палочку, которая затем синтезирует гормон. Такой инсулин более «биологичен», так как химически идентичен инсулину, вырабатываемому клетками поджелудочной железой человека.

Интерфероны – белки, синтезируемые клетками, главным образом в ответ на заражение организма вирусами. Интерфероны характеризуется видовой специфичностью. Например, у человека установлены три группы интерферонов, продуцируемых различными клетками под контролем соответствующих генов. Интерес к интерферонам определяется тем, что их широко используют в клинической практике для лечения многих болезней человека, особенно вирусных.

Имея крупные размеры, молекулы интерферона мало доступны для синтеза. Поэтому большинство интерферонов сейчас получают из крови человека, но выход при таком способе получения небольшой. Между тем потребности в интерфероне исключительно велики. Это поставило задачу изыскать эффективный метод производства интерферона в промышленных количествах. Генетическая инженерия лежит в основе современного производства «бактериального» интерферона.

Усилилось влияние генетической инженерии на технологию тех лекарственных веществ, которые уже давно создаются по биологической технологии. Еще в 40- 50-е гг. ХХ в. была создана биологическая промышленность для производства антибиотиков, которые составляют наиболее эффективную часть лекарственного арсенала современной медицины. Однако в последние годы отмечается значительный рост лекарственной устойчивости бактерий, особенно к антибиотикам. Причина заключается в широком распространении в микробном мире плазмид, детерминирующих лекарственную устойчивость бактерий. Именно поэтому многие знаменитые ранее антибиотики утратили свою былую эффективность. Единственный пока путь преодоления резистентности бактерий к антибиотикам – это поиски новых антибиотиков. По оценкам специалистов, в мире ежегодно создают около 300 новых антибиотиков. Однако большинство из них либо неэффективно, либо токсично. В практику же каждый год вводится лишь несколько антибиотиков, что заставляет не только сохранять, но и увеличивать мощность антибиотической промышленности на основе генно-инженерных разработок.

Основные задачи генной инженерии в тех технологиях лекарственных веществ, в которых продуцентами лекарств являются микроорганизмы, определяются необходимостью генно-инженерной реконструкции последних с целью повышения их активности. В то же время началась реализация идеи создания лекарств в виде малых молекул, что способствует их большей эффективности.

Значительный практический интерес представляет метод получения искусственного гемоглобина путем введения гемоглобиновых генов в растения табака, где под контролем этих генов продуцируются ά- иβ-цепиглобина, которые объединяются в гемоглобин. Синтезируемый в клетках табачных растений гемоглобин полностью функционален (связывает кислород). Клеточная инженерия в применении к человеку связана не только с решением фундаментальных проблем биологии человека, но и с преодолением, прежде всего, женского бесплодия. Поскольку частота положительных случаев имплантации в матку женщин эмбрионов, полученных invitro, является небольшой, то получение монозиготных близнецов-эмбрионов invitro также имеет значение, так как увеличиваются возможности повторных имплантаций за счет «запасных» эмбрионов. Особый интерес представляют перспективы использования стволовых клеток в качестве источника замены клеток и тканей в лечении таких болезней, как диабет, повреждения спинного мозга, боли сердца, остиоартриты, болезнь Паркинсона. Но для реализации этих перспектив необходимо углубленное изучение биологии стволовых клеток.

В использовании генетической инженерии применительно к проблемам медицины особое значение приобрела задача разработки генно-инженерных методов радикального лечения наследственных болезней, которые, к сожалению, еще не поддаются лечению существующими методами. Содержание этой задачи заключается в разработки способов исправления (нормализации) мутаций, результатом которых являются наследственные болезни, и в обеспечении передачи «исправлений» по наследству. Считают, что успешной разработке генно-инженерных методов лечения наследственных болезней будут способствовать данные о геноме человека, полученные в результате выполнения международной научной программы «Геном человека».