004 lec bio
.pdfМеханизмы переноса бактериальной ДНК
Конъюгация (А), трансформация с использованием отдельной молекулы ДНК (Б), трансдукция с помощью фагов
(В).
41
Получение
продуцентов
42
ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ МЕТОДАМИ СЕЛЕКЦИИ
Селекция – это направленный отбор мутантов – организмов, наследственность которых приобрела скачкообразное изменение в результате структурной модификации в нуклеотидной последовательности ДНК.
Основные этапы селекции
•Получение мутантов
•Отбор мутантов:
а) Отбор случайных (непредсказуемых) мутаций по количественному признаку;
б) Отбор по количественному признаку среди мутантов с определенным фенотипом.
Фенотип – совокупность всех признаков и свойств организма, сформировавшихся в процессе его индивидуального развития.
43
Селекция на устойчивость к структурному аналогу целевого продукта
Основа метода: отбор клонов с нарушенной негативной регуляцией собственного биосинтеза
E1 E2 E3
A → B → Lys → C
Если в клетке в результате мутации ферменты, участвующие в биосинтезе, станут нечувствительны к негативной регуляции лизином, эта клетка может стать сверхпродуцентом
S-(2-аминоэтил)цистеин (AEC) вызывает аллостерическое |
|
ингибирование бета-аспараткиназы |
44 |
Селективная среда
На среде с AEC вырастают только клетки, в которых нарушена негативная регуляция лизином, и поэтому они не чувствительныи к AEC.
Интактные клетки на этой среде не делятся, так как у них заблокирован биосинтез лизина
AE
Использование селективной средыпозволяет снизить количество исследуемых клонов до десятков
45
Ступенчатый отбор |
|
|
|
|
|
|
При конструировании сверхпродуцента Trp использовали следующие |
||||||
его структурные аналоги |
|
|
|
|
|
|
N селекции |
Дикий штамм |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
Выход (г/л) |
0.15 |
4.9 |
5.7 |
7.1 |
10.0 |
12.0 |
|
|
|
|
|
|
46 |
Отбор по биохимической недостаточности (ауксотрофности)
Две возможности конструирования сверхпродуцентов
Дикий штамм:
Сверхпродуцент:
Сверхпродуцент:
Lys
Увеличение Lys интенсивности
биосинтеза
Lys Х Х Уменьшение интенсивности
катаболизма
АУКСОТРОФНЫЕ (БИОХИМИЧЕСКИЕ) МУТАНТЫ -- мутанты бактерий с дополнительными питательными потребностями из-за потери способности синтезировать те или иные вещества вследствие повреждения генов.
47
Отбор по биохимической недостаточности (ауксотрофности)
Селекция в два этапа:
•После мутагенеза клетки высевают на полной среде
•Клетки всех клонов высевают на среде без вещества Х
Те клоны, которые не размножаются на этой среде -- ауксотрофы по Х, следовательно могут продуцировать Lys в больших количествах
Полная |
Полная среда |
Среда без Х |
Среда без Х |
48
ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ МЕТОДАМИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ
Ограничения использования метода селекции:
•1) нельзя скрещивать неродственные виды;
•2) нельзя извне управлять процессом рекомбинации в организме;
•3) нельзя предугадать, какое получится потомство.
49
Возможности генной инженерии
1.Можно скрещивать индивидуальные гены видов, стоящих на разных ступенях эволюции. В основе рекомбинации гетерологичных ДНК in vitro лежит прием, позволяющий с помощью рестриктаз подготовить молекулы для скрещивания, то есть разрезать разные ДНК с образованием одинаковых липких концов.
2.Можно управлять процессом рекомбинации, так как он происходит в пробирке и не защищен “запрещающими” механизмами организма.
3.Можно предсказать результат, т.к. отбирается потомство одной молекулы ДНК (молекулярное клонирование).
50