Практикум по генетике

Оптимизация ПЦР. Кроме оптимизации стандартных компонентов,

входящих в ПЦР реакцию, для повышения специфичности, выхода продукта или при использовании сложных ДНК-матриц можно использовать определенные вещества, влияющие на стабильность ДНК-

полимеразы, температуры плавления ДНК и ряд других факторов. Ниже приведены наиболее распространенные из них:

• DMSO	5% улучшает амплификацию GCбогатых матриц
• Формамид	1-5%	улучшение специфичности реакции
• Глицерин	10-15%	стабилизация фермента
• Бетаин Nа	0,5-2M	улучшает амплификацию GCбогатых
матриц

В любом случае их применение целесообразно только в случае очевидных проблем с прохождением ПЦР. Попытка «улучшения» нормально идущей реакции, приведет к обратным результатам.

Кроме добавок, добавляемых в реакцию с целью изменения ее протекания, существует целый ряд веществ, которые могут случайно попасть в амплификационную смесь, например, вместе с выделенной ДНК. Ниже приведены некоторые из них:

Агароза	не мешает до 1%
Изопропанол	ингибирование > 1%
NaCl	полностью ингибирует при 50 mM
Фенол	ПЦР не идет при 0,5%
Хлороформ	не влияет до 5%
ЭДТА	ПЦР не идет при 1mM

211

2.7Постановка реакции ПЦР

Впробирку на льду в следующем порядке вносят следующие компоненты:

1.	бидистилированная вода	18 мкл
2.	10 X раствор нуклеотидов (dNTP, 250 мкМ каждого) 2,5 мкл
3.	10 Х буфер для проведения ПЦР	2,5 мкл
4.	два праймера (50 pmol)	по 0,5 мкл каждого
5.	Taq-полимераза (2,5 ед./мкл)	0,5 мкл
6.	ДНК-матрица (100-200 нг)	0,5 мкл
Общий объем:		25 мкл
	После смешивания всех	компонентов в пробирку добавляют

минеральное масло. Масло предотвращает испарение реакционной смеси в результате нагрева пробирки. После добавления масла пробирку кратковременно откручивают на центрифуге (short-spin) для правильного разделения фаз. После этого запускают программу в амплификаторе и устанавливают пробирку в прибор. Программу для протекания ПЦР реакции оптимизируют в зависимости от температуры отжига праймеров,

нуклеотидного состава матрицы, типа матрицы, используемой в реакции.

Как правило, для нормально протекающей реакции дальнейшая оптимизация приведет к ухудшения выхода и специфичности продукта.

Стандартная программа для проведения ПЦР может выглядеть так:

940 С_____ 2 мин____0 сек				- начальная денатурация
950	С_____ 0 мин ____ 30 сек
550	С _____ 0	мин ____ 45	сек	35 циклов
720	С _____ 0	мин ____ 45	сек
720	С______7	мин_____00	сек -	конечная элонгация

40 С - хранение

212

5.8 Электрофорез.

Выделение отдельных молекул из смеси родственных молекул это ключевая техника для биологических исследований. Две наиболее известные технологии разделения молекул сегодня – хроматография и электрофорез. Электрофорез – совершенный аналитический инструмент когда используется для разделения макромолекул размером от 20 до 2000

кДа. На сегодняшний день нет других других биохимических методов разделения, для которых создано столько методов, как для техники электрофореза. С помощью этого метода можно достигнуть высокой эффективности разделения, используя ограниченное количество оборудования.

Принцип:

Под действием электрического поля заряженные молекулы и частицы мигрируют в направлении электрода с противоположным зарядом.

Частицы одинаковые по массе и заряду будут мигрировать с одинаковой скоростью и выделяться в отдельную фракцию.

На движение молекул ДНК влияют: концентрация геля, конформация молекулы ДНК, размер молекулы, велечина электического поля. А также концентрация и pH буфера, температура.

Электрофорез применяется в биологических и биохимических исследованиях, химии протеинов, фармакологии, клинических исследованиях, молекулярной биологии. Это техника настолько мощная,

что исследователь может использовать менее чем тысячные доли грамма образца для разделения сотен, даже тысяч различных типов молекул из одной навески.

Электрофорез в агарозном геле – стандартный метод, используемый для разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК.

213

Поскольку в растворе ДНК имеет отрицательный заряд, то под действием электрического поля движется к полюсу с противоположным зарядом (рис. 5.17). Чем крупнее молекула, тем больше заряд, а

следовательно и сила действующая на молекулу ДНК. Поскольку сопротивление среды растет не пропорционально, то скорость движения будет зависеть от длины молекулы. Если проводить электрофорез в растворе, то из-за тепловых флуктуаций разделения молекул достичь не удастся. Поэтому, электрофорез проводят в особом носителе – геле.

-

направление движения молекул ДНК

агарозный гель

+

Рис. 5.17. Электрофорез ДНК проводят в геле ДНК

Два наиболее широко применяемых геля для электрофореза – агароза и полиакриламид. Агароза – высокоочищенный комплексный полисахарид из красных водорослей. Размер пор 1% геля составляет примерно 150 нм. Агароза удобна для анализа фрагментов ДНК от нескольких сотен нуклеотидных пар до 20 т.п.н. Агарозный гель это комплекс связанных полимерных молекул, размер пор зависит от состава электрофорезного буфера, вида и концентрации используемой агарозы.

Агароза растворяется в водном буфере и полимеризуется при охлаждении.

214

Электрофорез проводят в особой камере с помещенным туда электродами и наполненного особым буфером (электрофорезный буфер) (рис. 5.18).

Рис. 5.18. Электрофорезная камера. Слева показаны гребенки,

которые после застывания геля формируют в нем лунки

Скорость миграции ДНК через агарозный гель определяется многими параметрами:

1. Концентрация агарозы – от концентрации агарозы, используемой для приготовления геля, зависит размер пор в агарозном геле и,

следовательно, сопротивление, которое испытывают молекулы ДНК при движении в геле. Для разделения фрагментов ДНК небольшого размера используют более концентрированный гель. Наиболее часто используют концентрацию – 1-1,5 %.

2.Конформация ДНК – скорость миграции ДНК сквозь гель зависит от ее формы. Кольцевые и линейные молекулы ДНК одного размера движутся с разной скоростью. Кольцевая будет двигаться быстрее сквозь поры геля, чем линейная.

3.Напряженность электрического поля – с возрастанием величины электрического поля возрастает скорость движения молекул ДНК.

Однако, если величина электрического поля будет непропорционально

высокой, скорость движения молекул ДНК разного размера будет

215

примерно одинакова и разделение их по размеру неэффективно. Для стандартного аналитического электрофореза оптимальным является напряженность 6 В/см.

4. Размер молекул ДНК – чем длиннее молекула ДНК, тем медленнее она движется в геле. Таким образом, после электрофореза более короткие фрагменты ДНК пройдут большее расстояние в геле.

Для окрашивания молекул ДНК в агарозных гелях чаще всего применяется флуоресцентный краситель – бромистый этидий. Этот краситель эффективно связывается с молекулой ДНК и светится под ультрафиолетом. Краситель связанный с ДНК флуоресцирует в 10 раз сильнее, чем находящийся в растворе. Для анализа результатов электрофореза используют особый прибор – трансиллюминатор.

Трансиллюминатор позволяет облучать гель ультрафиолетом, вызывая свечение бромистого этидия, связанного с ДНК.

При электрофорезе в агарозном геле используется однородная буферная система в течении всего времени разделения, чтобы обеспечить постоянное значение рН и определенную ионную силу. Одним из широко применяемых буферов для фореза является трис-боратный буфер (TBE).

Рядом с анализируемыми образцами добавляется смесь фрагментов ДНК с известными размерами. При анализе, этот маркер размеров используется для определения длин фрагментов в анализируемом образце (рис. 5.19).

216

600

500

400

300

200

100

Рис. 5.19. Для определения длины фрагментов исследуемой ДНК используют маркер размеров. На рисунке длина фрагментов маркера размеров (М) указана в парах нуклеотидов

Границы применения фореза варьируют от целых клеток и частиц до нуклеиновых кислот, протеинов, пептидов, аминокислот, лекарств и др.

веществ способных нести заряд.

Образец: важный критерий для выбора соответствующего метода электрофореза это природа навески, которая анализируется. Это не должна быть твердая частица и капля масла суспендированного в растворе,

поскольку будет блокироваться порами в матриксе.

Гель – электрофорез используется не только как аналитический метод, но и для очистки определенных фрагментов ДНК. Гель делают или из агарозы или из полиакриламида. Использующийся гель должен иметь регулируемый размер пор, быть химически инертным и не обладать электросмосом. Гели на основе агарозы наиболее используемые для анализа молекул свыше 10 нм в диаметре. Полиакриамид предпочтителен для более маленьких фрагментов ДНК.

Движение ДНК через гель, как предполагали, напоминает движение змеи. Однако, флуоресцентная микроскопия молекул подвергнутых электрофорезу обнаружило более сложную динамику. Молекулы ДНК показывают упругость растягиваясь в направлении приложенного поля и

217

затем сокращаясь в плотные клубки. Чем больше размер пор, тем больше клубок ДНК который может пройти сквозь и следовательно больше размер ДНК, которую можно разделить.

Ход работы:

1. Взвесить необходимое количество агарозы и добавить к отмеренному количеству электрофорезного буфера. Например, для приготовления 100

мл 1,5 % агарозного геля необходимо растворить 1,5 гр. агарозы в 100 мл буфера. Для растворения агарозы довести раствор до кипения.

2.Подготовить ванночку для электрофореза – вставить гребенку, заклеить торцы липкой лентой. Гребенка необходима для того, чтобы после застывания геля в нем образовались лунки для внесения образца (РИС. 18).

3.Остудить агарозу до 50-600С, добавить бромистый этидий до концентрации 0,5 мг/мл.

4.Залить агарозу в ванночку для электрофореза. Дать гелю застыть в течение 15-20 минут.

5.Залить в форезную камеру буфер для электрофореза и вставить ванночку с гелем. Буфер должен полностью покрывать гель.

6.Вытащить гребенку и внести образцы в лунки геля.

7.Для подготовки образцов необходимо смешать раствор ДНК со специальным буфером для внесения. Он содержит краситель для электрофореза и глицерин. Краситель облегчает внесение образца и позволяет отслеживать процесс электрофореза. Наиболее распространены красители – бромфеноловый синий, крезоловый красный, ксиленцианол.

Глицерин необходим для повышения плотности образца с тем, чтобы при внесении в лунку ДНК не растворялась в окружающем растворе. Обычно,

буфер для внесения имеет следующий состав: 0.25% бромфеноловый синий,

50% глицерин, 60 mM EDTA

218

8.После внесения образцов подключить электрический ток и провести электрофорез.

9.После проведения электрофореза выложить гель на трансиллюминатор и детектировать результат.

5.9 Рестрикция

Рестриктазы – бактериальные ферменты, которые узнают определенную последовательность нуклеотидов на молекуле ДНК («сайт рестрикции») и разрезают ДНК внутри этой последовательности (рис. 5.20). Рестрикцию фрагментов ДНК проводят в пробирке в специальном солевом буфере, специфичном для каждой рестриктазы.

Рис. 5.20. Рестриктазы расщепляют фосфодиэфирные связи между нуклеотидами

Ферменты рестрикции были обнаружены у микроорганизмов, где они в составе системы рестрикции-модификации (Р-М системы)

выполняют защитную роль – разрушают чужеродную ДНК, попадающую в клетку. В бактериальную Р-М систему входят два специфичных для каждого штамма типа фермента – метилазы, модифицирующие ДНК в сайтах рестрикции и расщепляющие ДНК в определенных сайтах

219

рестрикции (эндонуклеаза рестрикции - рестриктаза). С помощью специальных метилаз, собственная клеточная ДНК модифицируется так,

что рестриктазы оказываются неспособны разрезать ее в специфических сайтах рестрикции. Однако, любая чужеродная ДНК, вторгающаяся в клетку, оказывается чувствительна к действию рестриктаз.

К настоящему моменту известно более 3000 рестриктаз, «узнающих» около 200 различных сайтов рестрикции. Рестриктазы

«узнающие» одни и те же сайты рестрикции называют изошизомеры.

Уникальные сайты рестрикции характеризуются большим разнообразием первичной структуры. Более половины из известных рестриктаз узнают четырех-, шести- и восьминуклеотидные последовательности, являющихся палиндромами - обращенными повторами (сайты с идентичными последовательностями нуклеотидов в направлении 5'->3' на комплементарных цепях ДНК). Например:

Alu I : 5'-AGCT-3'

3'-TCGA-5'

Bam HI 5’ GGATTC 3’

3’ CCTAAG 5’

Sbf I 5'-CCTGCAGG-3'

3'-GGACGTCC-5'

При работе с чистыми препаратами рестриктаз необходимо соблюдать осторожность, поскольку, как и многие другие ферменты они теряют активность при комнатной температуре, поэтому их необходимо хранить в морозильнике, при температуре не выше -180С, а

транспортировать и использовать в лабораторных условиях только во льду.

Однако, даже при соблюдении всех мер предосторожности срок жизни

(сохранение активности и специфичности гидролиза) большинства

220