Микробиологическая диагностика микозов Микроскопическое исследование
Микроскопия – это один из основных методов в лабораторной диагностике микозов. Проводить это исследование необходимо с того дня, когда на питательной среде появляются первые колонии. Перед микроскопическим исследованием необходимо знать является гриб дрожжевым или плесневым – по внешнему виду колоний, результатам проростковой пробы.
При микроскопии плесневых грибов учитывают структуру мицеллия (т.е. особенности строения гиф, их цвет, септированность; особенности строения конидиев и спор, включая размер, форму, цвет конидиев; строение их клеточной стенки, септированность и т.д.)
Для проведения микроскопии готовят нативные и окрашенные препараты. Для приготовления окрашенных препаратов материал обрабатывают различными способами:
1. Окраска PAS-методом. Использование РAS-метода позволяет выявить нейтральные полисахариды в стенках микроорганизмов. Нейтральные полисахариды – это глюкан-маннановый комплекс, находящийся в клеточной стенке большинства эумицетов, за счет него и происходит окрашивание.
PAS-реакции – один из методов микроскопической диагностики тканевых форм грибковой инфекции. В практических лабораториях для микроскопической диагностики используются различные модификации этого метода: окисление хромовой кислоты – реакция Бауэра; окраска по Гридли.
2. Окраска по методу Грама (модификация по Грам-Вайгерту) для выявления сопутствующих микроорганизмов.
3. Окраска по Циль-Нильсону для выявления кислотоустойчивых микроорганизмов. Если исследуемый материал жидкий, то из него готовят неокрашенный мазок для микроскопии в просветляющих жидкостях: смесь спирта с глицерином в соотношении 1:1.
Следующий этап это микологическое исследование – выделение и идентификация грибов. Рассмотрим особенности этого этапа в зависимости от исследуемого материала.
Микологическое исследование
Культуральное исследование. Культуральное исследование основано на выделение возбудителя из исследуемого материала. Сроки культивирования различны для разных видов грибов (от 2-4 дней до 4 недель), при подозрении на диморфные грибы культуру выделяют до 8 недель. Основными средами для культивирования в микологической лаборатории является среда Сабуро: декстрозный агар Сабуро (плотная среда), бульон Сабуро (жидкая среда). Для подавления роста бактериальной флоры в среду Сабуро добавляют антибиотики (хлорамфеникол, гентамицин, реже стрептомицин, пенициллин). Для подавления роста сапрофитных грибов в среду добавляют циклогексимид, хлорамфеникол. Существуют готовые среды с циклогексимидом (Mycobiotic Mycosel).
Оптимальным режимом культивирования для большинства патогенных грибов является 300С, 20-250С, реже 370С – при подозрении на диморфные грибы. Длительность инкубации для большинства грибов составляет до 6 недель; если по прошествию этого времени роста не наблюдается, то дают отрицательный ответ. В случае подозрения на диморфный микоз при отсутствии роста в течение 6 недель, культуру выдерживают 8 недель и только после этого дают отрицательный результат.
При культуральном исследовании диагностически значимымявляются:
- выделение плесневого или дрожжевого гриба, при исследовании стерильного в норме материала;
- выделение диморфного гриба.
Алгоритм микологического исследования
1. Определение грибковой этиологии возбудителя (микроскопия).
2. Определяют дрожжевой гриб или плесневый:
- микроскопия клинического материала (наличия мицеллия);
- характер колоний на питательной среде, скорость роста (дрожжевые грибы растут 48 часов, плесневые грибы растут медленно).
3. Окончательную идентификацию гриба до уровня вида (внутривидовая) проводят с использованием биохимических тестов и иммунологических методов. При исследовании биохимических свойств изучают способность выделенной культуры к ассимиляции (ауксанограмма) и ферментации (зигограмма). Возможно использование автоматизированных систем идентификации (тест-системы для идентификации грибов).
Критерии этиологической значимости выделения условно-патогенных грибов
1.Если в нативном препарате видны только бластоспоры (сапрофитная вегетация) то это расценивается как носительство.
2.Если в нативном препарате преобладают бластоспоры и появляются единичные нити псевдомицелия, то это сигнал о переходе гриба к паразитизму.
3.Если бластоспоры единичные и преобладает псевдомицелий, то это признак глубоких органных поражений.
4.Активное почкование бластоспор – свидетельство острого процесса.
5.Количественную оценку результатов – выделение гриба из разведений
-10 -фекалии , моча;
- 10 – мокрота.
6.Повторность высеваемости одного и тогоже вида гриба
7. Наличие антител к выделенному штамму.
Микологическое исследование отделяемого слизистых
1. Подготовка материала. После забора материала со слизистых тампон помещают в 2 мл жидкой среды Сабуро или сусло-агара, или МПБ, разлитого в стерильные пробирки. Их тщательно встряхивают в течение 5 минут, стараясь не замочить пробку. Из полученной взвеси готовят ряд разведений 1:10 и 1:100 и т.д.
2. Культуральное исследование.
Из каждого разведения высевают по 0,1мл на 2 чашки сусло-агара, агара Сабуро или МПА. Посевы на плотных средах и пробирку с жидкой средой с тампоном для обогащения инкубируют при +370С в течение 48 часов:
- после пройденного времени посевы просматривают и подсчитывают число колоний и ориентировочно определяют количество дрожжевых колоний. Их количество умножают на 20 и на разведение, из которого сделан высев;
- если на чашках с посевом, сделанным из разведений роста нет, то делают повторный посев из среды обогащения в чашку с сусло-агаром.
Микологическое исследование крови
1. Подготовка материала. После забора крови ее разводят 1:10, для того, чтобы бактерицидные свойства крови не ингибировали рост грибов.
2. Культуральное исследование.
- 5-10мл крови засевают в 50-100 мл жидкой среды Сабуро с 2% глюкозой. При температуре 370С их инкубируют в течение недели;
- через 5 дней делают контрольный высев. Для этого стерильной пипеткой забирают осадок 3-4 капли из пипетки засевают на сусло-агар и растирают стерильной бактериологической петлей;
- засеянные чашки в течение 2-5 дней держат в термостате при 370С;
- если обнаружен рост, то выдают предварительный ответ о фунгемии, а дальнейшую идентификацию гриба проводят в ходе исследования.
Микологическое исследование биоптатов
1.Для забора материала используют метод отпечатков.
2. Культуральное исследование:
- делают отпечаток исследуемым кусочком ткани на поверхность плотной питательной среды Сабуро;
- этот же кусочек ткани помещают в 50мл жидкой питательной среды (сусло или Сабуро);
- посевы инкубируют при 370С в течение 5 дней.