А.Обнаружение полифенолоксидазы и пероксидазы

Оксидазами называют ферменты, активирующие молекулярный кислород (переносящие на него электроны от окисляемого вещества). Активированный таким образом кислород соединяется с отщепляемым от субстрата водородом, образуя воду или пероксид водорода по схеме:

2АН₂ + О₂ → 2А + 2Н₂О

К этой группе ферментов относится полифенолоксидаза, окисляющая полифенолы кислородом воздуха с образованием соответствующих хинонов.

Пероксидаза - фермент, окисляющий полифенолы и ароматические амины кислородом пероксида водорода:

дифенол + Н₂О₂ → хинон + 2Н₂О

Обнаружить полифенолоксилазу можно при помощи раствора гваяколовой смолы, который в присутствии этого фермента изменяет окраску из желтой в синюю. Объясняется это тем, что содержащиеся в гваяколовой смоле полифенолы, не способные самопроизвольно реагировать с молекулярным кислородом, окисляются активированным кислородом.

Для обнаружения пероксидазы можно использовать ту же реакцию окисления полифенолов гваяколовой смолы. Но так как пероксидаза с молекулярным кислородом не реагирует, к раствору гваяколовой смолы необходимо добавить пероксид водорода.

Работу удобно проводить на двух срезах исследуемой части растения, нанося на первый срез раствор гваяколовой смолы, на второй – растворы гваяколовой смолы и пероксида водорода: изменение окраски первого среза свидетельствует о присутствии в клетках полифенолокисдазы, тогда как посинение второго среза есть результат совместного действия двух ферментов – полифенолокисдазы и пероксидазы или, в случае отсутствия в данном объекте первого фермента, – одной пероксидазы (показатель присутствия обоих ферментов – более быстрое посинение второго среза).

Ход работы

Поместить на стекло два среза клубня картофеля и нанести на них одновременно раствор гваяколовой смолы, причем второй срез дополнительно обработать каплей раствора пероксида водорода. Для контроля обработать таким же образом материал, предварительно подвергнутый кипячению (вареный картофель).

Исследовать несколько объектов, не допуская при этом попадения сока из одного объекта на срез другого (скальпель, используемый для разрезания исследуемых объектов, необходимо каждый раз мыть и вытирать).

Зарисовать результаты опыта, отмечая скорость появления синей окраски. В выводах указать наличие или отсутствие в исследуемых объектах полифенолоксидазы и пероксидазы и ориентировочно оценить активность этих ферментов (полифенолоксидазы - по посинению 1-го среза, пероксидазы – по разности скоростей посинения 2-го и 1-го срезов).

Б.Обнаружение каталазы.

Каталаза выполняет в клетках функцию обезвреживания очень активного и потому опасного для живых клеток окислителя – пероксида водорода, катализируя реакцию:

2Н₂О₂ → 2 Н₂О + О₂

Этот фермент особенно активен в молодых растущих тканях, а также в зеленых листьях, где участвует в процессе фотодыхания.

Ход работы

Готовят срезы листьев толщиной 0,5-1 мм, с побегов элодеи можно отрывать целые листья. Часть срезов и листьев убивают, опуская их в кипящую воду.

Живые и убитые срезы помещают на предметное стекло в капле воды и добавляют несколько капель раствора перекиси водорода. В микроскоп на малом увеличении рассматривают срезы и отмечают появление пузырьков кислорода.

Результаты зарисовывают, объясняя появление пузырьков кислорода или их отсутствие.