ext_5251

ГЛАВА 6. Биотехнологии и наномедицина

нам прокариотах – первых живых существах, населявших нашу планету еще со времен Архейской эры. Как уже говорилось, ме ханизмы передачи генетической информации в природе обла дают высокой стабильностью, призванной служить сохране нию и выживанию вида. Стабильность эта, однако, не абсолют на, ведь иначе в ходе эволюции не смогло бы возникнуть тако го многообразия форм жизни, свидетелями (и представителя ми) которых мы являемся.

Но прокариоты, как известно, размножаются простым де лением, при котором каждая дочерняя клетка получает «в нас ледство» точную копию родительской ДНК. Откуда же возник ло такое разнообразие в среде самих простейших и как могли появиться другие организмы? Одна из наиболее очевидных причин генетической изменчивости – это мутации, являющие ся, по меткому выражению Дарвина, двигателем эволюции.

Мутации – cкачкообразные изменения генетического кода клетки, приводящие к появлению новых признаков. Если по томки измененной особи имеют некоторое преимущество пе ред обычными, например, большую жизнеспособность или по вышенную скорость роста, они постепенно накапливаются и вытесняют исходных особей.

Различают мутации спонтанные (причины их возникнове ния неизвестны) и индуцированные. Индуцировать мутации мо гут различные факторы, действующие на генетический матери ал клетки: физические, химические или биологические.

В ходе эволюции прокариоты выработали способы защиты своего генетического материала от повреждающего действия облучения, химических веществ и других мутагенов. В их клет ках обнаружены эффективные системы ремонта поврежденных участков ДНК. Если бы таких механизмов не было, то организм бы переродился и вымер как вид.

Основной механизм восстановления ДНК – это “выреза ние” повреждений, так называемая рестрикция. Ее осуществля ют ферменты эндонуклеазы, расщепляющие нить ДНК. Такой способ помогает, только если повреждена только одна цепочка молекулы. Тогда поврежденный участок вырезается, а образо вавшаяся брешь заполняется комплементарными нуклеотида ми с использованием в качестве матрицы шаблона неповреж денной нити ДНК. Таким образом, многие случайные мутации попросту вырезаются.

www.nanonewsnet.ru

293

НАНОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ВСЕХ

Однако когда повреждение касается обеих нитей, тот же са мый механизм восстановления превращается в орудие самоубий ства: эндонуклеазы распознают поврежденный участок и разры вают в его месте обе нити ДНК. Кстати говоря, то же самое про исходит и в клетках многоклеточных организмов в случае фаталь ного повреждения хромосом. Такое генетически запрограммиро ванное самоубийство биологи называют апоптозом. Оно сохра няет «чистоту генов» и предохраняет вид от деградации. Можно сказать, что клетка руководствуется своеобразным “клеточным самурайским законом” – “лучше умереть, чем ошибиться!”

Однако присущий всем живых существам инстинкт самосох ранения порой все же берет верх, и клетке мутанту удается “об мануть” убийственную рестрикцию путем модификации ДНК – метилированием или введением дополнительных пар нуклеоти дов. Уцелевшая клетка приобретает новые свойства и, если они оказываются выгодными, дает начало новому виду существ.

Итак, огромное разнообразие организмов объясняется му тациями. Но, как оказалось, тому есть и другие причины. С раз витием генетики ученые обнаружили, что для прокариот харак терен путь горизонтального переноса генов между различными особями. Молекулярно генетический анализ показал, что ге номы прокариот представляют собой мозаику генов, приобре тенных у разных видов. Одинаковые генетические последова тельности можно увидеть у многих прокариот, вне зависимости от степени их родства. Объяснить возникновение такой мозаи ки может только горизонтальный перенос генов.

Горизонтальный перенос генов у прокариот – это не просто лабораторный артефакт или результат генной инженерии, а распространенное природное явление.

Установлены три основных механизма латерального пере носа: трансформация, коньюгация и трансдукция.

Трансформация – это нормальная физиологическая функ ция обмена генетическим материалом у некоторых бактерий.

Конъюгация имеет наименьшее число ограничений для межвидового обмена генетической информацией, но предпола гает тесный физический контакт между микроорганизмами, легче всего достижимый в биопленках.

Трансдукция (от лат. transductio – перемещение) – это пере нос генетического материала из одной клетки в другую с по

294

ГЛАВА 6. Биотехнологии и наномедицина

мощью некоторых вирусов (бактериофагов), что приводит к из менению наследственных свойств клетки реципиента. Явление трансдукции было открыто американскими учеными Д. Ледер бергом и Н. Циндером в 1952.

Последний механизм следует рассмотреть более подробно, но прежде скажем несколько слов о вирусах.

Вирусы (от лат. virus – яд) были открыты в 1892 г. русским уче ным ботаником Д. И. Ивановским при изучении мозаичной бо лезни (пятнистости листьев) табака. К наиболее опасным заболе ваниям, вызываемым вирусами у животных и человека, относят бешенство, оспу, грипп, полиомиелит, СПИД, гепатит и др.

Вирусы – существа совершенно удивительные. Они зани мают промежуточное положение между живой и неживой мате рией, представляя собой случай некого биологического дуализ ма. На вопрос “живые ли вирусы?” нельзя ответить однознач но, ведь если живой считать структуру, способную к размноже нию и обладающую наследственной информацией, то можно сказать, что вирусы живые (впрочем, по этому определению живыми можно признать и компьютерные вирусы). Но если считать живой структуру, обладающую клеточным строением (как, например, растения, грибы, животные), то ответ должен быть отрицательным. Следует также отметить, что вирусы не способны воспроизводить себя вне клетки хозяина.

Вирусы устроены очень просто. Они состоят из головки (серд цевины) округлой, гексагональной или палочковидной формы диаметром 45 140 нм и отростка толщиной 10 40 и длиной 100 200 нм. В 1 мм3 воды может уместиться около миллиарда фагов.

Рис 187. Электронно микроскопическая фотография и схема строения бактериофага T4

www.nanonewsnet.ru

295

НАНОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ВСЕХ

Сердцевина вируса содержит ДНК или РНК. Ее окружает защитная белковая оболочка (капсид). Отросток имеет вид по лой трубки, окруженной сократительными белками вроде мы шечных. На конце отростка у многих вирусов есть базальная пластинка, от которой отходят тонкие длинные отростки «но ги», служащие для прикрепления к клетке хозяину.

Вирус может воспроизводить себе подобных только внед ряясь в клетку хозяина. Для этого он прикрепляется к бактери альной клетке и растворяет клеточную стенку, выделяя особый фермент. Затем содержимое головки по канальцу отростка про никает в клетку. Попав внутрь клетки, вирус, подобно своему компьютерному собрату, перепрограммирует рибосомы на про изводство своих копий. Он «выключает» хозяйскую ДНК и, ис пользуя свою собственную ДНК или РНК, «заставляет» клетку синтезировать новые копии вируса. После сборки большого числа вирусных частиц клетка, как правило, погибает, а множе ство новых вирусов, произведенных с ее помощью, выходит на свободу, поражая другие клетки. Вирусы, вызывающие гибель клетки, называют вирулентными19.

Рис 188. Жизненный цикл вирулентного фага, например Т2 или Т4

19 Вирулентность – это степень болезнетворного действия микроба. Ее можно рассматривать как способность адаптироваться к организму хозяина и преодолевать его защитные механизмы.

296

ГЛАВА 6. Биотехнологии и наномедицина

Однако существует и другая категория вирусов, называе мых умеренными (симбиотическими). Проникая внутрь клетки, они могут либо повести себя как обычные фаги, вызывая ги бель клетки, либо могут встроиться в ДНК клетки хозяина и остаться в ней в скрытой неинфекционной форме.

Клетки, содержащие такой вирус, называются лизогенными, они могут содержать 2, 3 и более фагов. Лизогения может затем передаваться потомству бактерии. На рисунке показаны два возможных пути развития умеренного вируса.

Рис 189. Жизненный цикл умеренного фага. Когда он инфицирует клетку, развитие может пойти по литическому или лизогенному пути

Так, а что же наш «горизонтальный перенос»? Напоминаем, что трансдукция – это перенос вирусом бак

териальных генов из одной клетки в другую, что приводит к из менению наследственных свойств клетки реципиента.

Трансдукция возможна, если в процессе размножения умеренного фага одна из частиц вирусной ДНК случайно захватит фрагмент бактериальной хромосомы

www.nanonewsnet.ru

297

НАНОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ВСЕХ

Когда впоследствии такой вирус заражает другую бакте рию, участок бактериальной ДНК проникает в клетку таким же путем, как вирусный. Между трансдуцированной ДНК и участ ком хромосомы может произойти обмен, и как следствие его возникают рекомбинанты, несущие небольшую часть генети ческого материала клетки донора.

Рис 190. Схема общей трансдукции между линиями Е. coli: а) Клетка дикого типа, инфицированная фагом P1;

б) ДНК клетки хозяина деградирует в ходе литического цикла; в) в ходе сборки фаговых частиц некоторые фрагменты бактериальной хромосомы

включаются в несколько фагов потомков, что потом приведет к трансдукции; г) лизис; д) трансдуцирующий фаг инфицирует бактерию реципиента;

е) происходит обмен донорного гена а+ и реципиентного гена а ; ж) образование стабильного трансдуктанта а+.

Итак, мы рассмотрели процесс естественного “горизон тального” обмена генетической информацией между бактерия ми, то есть перемещения генов из одного организма в другой

298

ГЛАВА 6. Биотехнологии и наномедицина

посредством мобильных генетических посредников. Рассмот ренный механизм получил название трансдукции, а понимание его сути привело к рождению генной инженерии.

Как уже было сказано, суть генной инженерии заключается в том, что в генотип организма встраиваются или исключаются отдельные гены или их группы. Для этого используют метод по лучения рекомбинантных, т. е. содержащих чужеродный ген, ДНК, которые затем вводятся в организм реципиента и стано вятся составной частью его генетического аппарата.

Этот процесс состоит из нескольких этапов:

1. Чтобы выделить тот или иной ген из цепочки ДНК, ис пользуется рестрикция – разрезание ДНК на фрагменты уже знакомыми нам ферментами рестриктазами. Они попросту «шинкуют» ДНК: режут на отрезки, но не как попало, а в опре деленных местах. Всякая рестриктаза может опознать лишь од ну стандартную последовательность из нескольких нуклеоти дов. Молекулы рестриктазы химически связываются с ними и в этих местах рвут цепь ДНК. На рисунке изображена схема рас щепления ДНК по остаткам А (аденин).

Рис 191. Схема получения фрагментов ДНК в результате расщепления по определенному нуклеотиду (А)

В настоящее время известно более 400 рестриктаз, способ ных расщеплять ДНК по 120 различным последовательностям нуклеотидов.

2. Лигирование – процесс «сшивания» генов с помощью особых ферментов, называемых лигазами. Лигазы сшивают участки ДНК, образовывая между их крайними нуклеотидами химическую связь.

www.nanonewsnet.ru

299

НАНОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ВСЕХ

3. После того как рекомбинантная ДНК сшита, ее вводят в

живые клетки. Этот процесс называется трансформацией. Для того, чтобы рекомбинантная ДНК стала частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться в ее геном и реп лицироваться за ее счет, либо быть способной к автономной репликации. Для этого используют векторы – мобильные гене тические элементы: вирусы, плазмиды и транспозоны. Эти эле менты могут присоединять те или иные гены к своей ДНК, а за тем, оказавшись в клетке хозяине, встраиваться вместе с «отор ванным» чужеродным геном в хромосому хозяина, которая по том реплицируется уже вместе со всей этой новой последова тельностью. В общих чертах это напоминает трансдукцию, имеющую, как мы убедились, место и в природе.

Итак, мы познакомились с общими принципами искусствен ного конструирования молекул ДНК. Рассмотрим теперь нес колько примеров практического применения генной инженерии.

Получение инсулина

Инсулин – гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и уровень сахара в крови. Его недостаток в организме приводит тяжелейшему заболеванию – сахарному диабету, самой распространенной форме заболеваний эндок ринной системы. Самая тяжелая форма диабета, для лечения которой больному необходим инсулин, вызвана гибелью кле ток, синтезирующих этот гормон.

Раньше инсулин могли выделять только из поджелудочной железы телят и свиней. Для получения 100 г кристаллического инсулина требовалось 800 1000 кг исходного сырья. Однако с развитием генно инженерных методов в 1978 г. был получен штамм бактерий Е. coli (кишечной палочки), способных про дуцировать инсулин. В ДНК бактерии был встроен человечес кий ген, отвечающий за его синтез. Теперь почти весь инсулин в мире производят трансгенные бактерии.

Получение соматотропина

За синтез соматотропина (гормона роста человека) отвечает передняя доля гипофиза. Его недостаток приводит к гипофизар ному нанизму – карликовости (в среднем 1 случай на 5000 чело век). Пригодный для лечения людей соматотропин можно выде лить лишь из гипофиза человека, поэтому раньше его получали

300

ГЛАВА 6. Биотехнологии и наномедицина

из трупов, но в ничтожных количествах: гормона хватало лишь для лечения 1/3 случаев карликовости, и то лишь в развитых странах. Препарат, выделяемый из трупов, имеет некоторые спе цифические особенности, приводящие к тому, что у 30% боль ных, получавших препарат, против гормона вырабатывались ан титела, что сводило на нет его биологическую активность.

Сейчас гормон роста синтезируют с помощью специально сконструированных бактерий Е. coli. Впервые такую бактерию удалось получить в 1979 году.

Получение интерферонов

В 1957 году в Национальном институте медицинских иссле дований в Лондоне было установлено, что клетки человека и животных, подвергнутые воздействию вируса, выделяют веще ства, придающие непораженным клеткам устойчивость к ви русной инфекции. Они как бы препятствуют (интерферируют) размножению вирусов в клетке и поэтому были названы интер* феронами. Интерфероны помогают нашему организму бороться со множеством вирусных заболеваний.

Препараты на основе различных видов интерферонов ис пользуются как иммуномодуляторы – для нормализации и уси ления иммунной системы, в т. ч. для лечения различных тяже лых заболеваний – острого вирусного гепатита, рассеянного склероза, остеосаркомы, миеломы и некоторых видов лимфом. Их применяют и для лечения меланом, ряда опухолей гортани, легких и мозга.

Традиционно интерфероны извлекали из крови человека. Из 1 л крови можно выделить всего 1 мкг интерферона, то есть примерно одну дозу для инъекции. На современном этапе ин терфероны получают с помощью генетически модифицирован ных микроорганизмов. Удалось получить штаммы бактерий, способные синтезировать до 5 мг интерферона на литр бакте риальной суспензии, содержащей примерно 1011 бактерий, что заменяет кровь 25 000 доноров.

Трансгенные животные

Применение методов генной инженерии в животноводстве позволяет повышать продуктивность животных (например, удои молока), сопротивляемость их организма к болезням и т. д. Жи вотных, имеющих в своем геноме чужой ген, принято называть

www.nanonewsnet.ru

301

НАНОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ВСЕХ

трансгенными. Благодаря переносу генов у трансгенных живот ных возникают новые качества, а дальнейшая селекция позволя ет закрепить их в потомстве и создавать трансгенные линии.

Так, были получены животные*биореакторы, способные выделять ценные биологические вещества. Например, в России группой ученых под руководством Л. К. Эрнста была выведе на трансгенная овечка, которая с молоком выделяет химозин – фермент, используемый в производстве сыра. Не так давно для сыроваренной промышленности требовалось огромное коли чество желудков телят. В последние несколько десятков лет практически все сыроделы пользуются химозином, получен ным методом микробиологического синтеза из культур бакте рий и микроскопических грибков. Очевидно, что такое получе ние химозина не только гуманнее, но и выгоднее традицион ных способов, требующих убийства сотни телят. Всего из 3 л молока трансгенной овцы можно получить достаточно химози на для производства тонны сыра – и при этом не тратиться ни на работу ферментера, ни на выделение из культуральной жид кости нужного фермента и его очистку.

Другой пример – трансгенная корова, которая выделяет с молоком лекарственный препарат эритропоэтин, применяе мый в терапии лейкозов. Ведутся исследования по получению многих других лекарств из молока животных. Применяемые для этого биотехнологические методы с использованием бакте рий дороги и сложны. А трансгенные животные быстро размно жаются, и выход полезных веществ с их молоком превосходит таковой у бактерий.

Другая важная задача – выведение животных, устойчивых к заболеваниям. Потери в животноводстве, вызванные болезня ми, достаточно велики, но уже созданы популяции трансген ных коров и кур, устойчивых к некоторым паразитам.

Трансгенные растения

Тысячи лет люди выводят новые сорта растений путем от бора экземпляров с новыми свойствами, полученными в ре зультате случайных мутаций. С начала ХХ века стали целенап равленно применять облучение и химические мутагены, слия ния соматических клеток и т. д., а скрещивание и отбор стали проводить с учетом законов Менделя. При этих традиционных

302