Тема седьмая устойчивость растений к неблагоприятным факторам среды

Способность к защите от неблагоприятных и повреждающих факторов среды – обязательное свойство организма растений (такое же, как и фотосинтез, минеральное питание, дыхание и т.д.). Ответные реакции, индуцируемые внешними воздействиями, часто объединяют терминами адаптационный синдром (adaptive syndrome) либо широко распространившимся ныне понятием стресс. Ганс Селье, впервые в 1936 г. предложивший этот термин, назвал комплекс ответных реакций организма «генерализованным адаптационным синдромом», в котором выделил три стадии:

1 стадия тревоги и торможения большинства процессов (для растений, не имеющих нервной системы, это первичная стресс-реакция, когда идут отклонения в физиолого-биохимических процессах);

2 стадия адаптации – когда идет выработка приспособления к стрессору;

3 стадия истощения – когда адаптивный потенциал организма достаточен или недостаточен для преодоления стресса. Если это происходит при сверхвысокой напряженности стресса - организм гибнет.

В последнее время показано, что изменения в метаболизме, физиологических функциях и ростовых процессах при стрессе связаны с изменениями экспрессии генов. Ответ на действие стрессора происходит если растение распознает стрессор, т.е. происходит первичная рецепция сигнала на клеточном уровне. Абиотические стресс-факторы (засоление, засуха, пониженная или повышенная температура и др.) обычно активизируют рецепторы, расположенные в плазмалемме, а далее через различные интермедиаты (протеинкиназы, фосфатазы) срабатывает сигнальная цепь, и образуются транскрипционные факторы, которые активируют в ядре гены путем связывания их со специфическими промоторами. Срабатывает последовательная цепь событий: стресс-сигнал → рецептор плазмалеммы → сигнальная цепь в цитозоле с ее усилением → активация транскрипционного фактора в ядре → промотр стресс-индуцированного гена → активация мРНК → стресс-белок → выполнение им защитной функции → приобретение растением устойчивости к данному сресс-фактору.

Подавляющая часть клеточных механизмов устойчивости сформировалась на ранних этапах эволюции и поэтому защитные системы проявляющиеся на клеточном уровне у высших растений и защитные системы примитивных организмов (дрожжей, бактерий, простейших) идентичны и имеют общую основу.

Под устойчивостью понимают способность растений сохранять постоянство протекания процессов и внутренней среды (поддерживать гомеорезис и гомеостаз) и осуществлять полный жизненный цикл в условиях действия стрессоров.

При действии стрессоров могут происходить изменения метаболических процессов, затрагивающие экспрессию генов, и растения приобретают устойчивость в онтогенезе, заложенную в генотипе (т.е. в пределах нормы реакции). Совокупность такого рода реакций называется акклимацией, она происходит при жизни организма и не наследуется. Ярким примером акклимации является закаливание. И очень часто выработка устойчивости в онтогенезу к одному стресс-фактору способствует перенесению отрицательного действия множества других. Например, предварительный тепловой шок растений хлопчатника защищал его от последующего засоления, прогрессирующей засухи, тяжелых металлов и ультрафиолетовой радиации (В.В. Кузнецов, 2007). Такое явление Генкель определял как «сопряженную» устойчивость, и в последнее время данное явление называют кросс-адаптацией.

Важную роль в устойчивости растений к стрессорам играют адаптации. В отличие от акклимации адаптации - наследственно закрепленный конститутивный признак, присутствующий в организме независимо от того, испытывает растение стрессовые условия или нет. Такие адаптации делают популяцию хорошо приспособленной к условиям окружающей среды. Такие адаптации проявляются как на морфологическом уровне (например, кактусы), так и на биохимическом (выработка токсичных алкалоидов у пасленовых против поедания фитофагами).

В заключение следует отметить, что именно устойчивость к неблагоприятным условиям среды определяет характер распределения различных видов растений по климатическим зонам Земли. Большинство же сельскохозяйственных культур вынуждены постоянно находиться в стрессовых ситуациях и поэтому обычно они реализуют лишь только 20% генетического потенциала продуктивности (С.С. Медведев, 2004). Для эффективного выращивания растений в условиях агрокультуры важна не только потенциальная продуктивность, но и высокая способность противостоять и успешно адаптироваться к неблагоприятным стрессовым сдвигам.

Работа 11. Криопротекторное действие углеводов и глицерина на цитоплазму

При воздействии отрицательных температур на растительные ткани в межклетниках образуется лед, который, оттягивая воду из клеток, обезвоживает протопласт. При определенной степени обезвоживания, характерной для каждого растительного организма, протоплазма коагулирует. Но еще хуже, когда кристаллы льда, образуются непосредственно в клетках.

Механическое воздействие льда нарушает внутреннюю субмикроскопическую структуру протоплазмы, резко повышая ее проницаемость, что при длительной экспозиции на морозе приводит к ее гибели.

Скорость отмирания протоплазмы зависит от температуры и времени экспозиции, и от водоудерживающей способности самой клетки. Увеличение количества растворимых углеводов в зимующих органах растений понижая водный потенциал повышает водоудерживающую способность тканей. Накопившиеся сахара, а также глицерин, обладая криопротекторными свойствами, обеспечивают более высокую зимостойкость растений.

ХОД РАБОТЫ

Из поперечного среза красной свеклы толщиной 0,5 см при помощи пробочного сверла диаметром 5-6 мм делают высечки. Тщательно ополаскивают их водой и помещают в три пробирки по 3-4 высечки в каждую. В первую пробирку наливают 5 мл дистиллированной воды, во вторую 5 мл 1 М раствора сахарозы, в третью - 5 мл 2 М раствора сахарозы, в четвертую – 12%-ный глицерин, в пятую – смесь 1:1 12%-ный глицерин и 2 М раствор сахарозы. Пробирки на 20 минут погружают в охладительную смесь до полного замораживания, состоящую изо льда или снега и поваренной соли в соотношении 3:1. Затем пробирки вынимают из охладительной смеси и размораживают в стакане с водой комнатной температуры.

Отмечают различия в интенсивности окрашивания жидкостей в пробирках, объясняют их. Из дисков готовят тонкие срезы и рассматривают их под микроскопом при малом увеличении в капле того же раствора, в котором они находились. Подсчитывают общее количество клеток в одном поле зрения и число обесцвеченных, из которых вышел антоциан, вследствие нарушения внутренней структуры протопласта при замерзании.

Результаты опыта заносят в таблицу:

Условия опыта	Число клеток в поле зрения микроскопа		Окрашенных клеток от общего количества	Выводы
	всего	окрашенных
Дистиллированная вода
Сахароза 1 М
Сахароза 2 М
Глицерин 12%
Глицерин 12% + сахароза 2 М

Сделать выводы о протекторной роли сахарозы и глицерина и их смеси в сохранении жизнеспособности клеток.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) корнеплоды свеклы; 2) 1 и 2 М растворы сахарозы; 3) 12%-ный глицерин; 4) поваренная соль; 5) лед или снег; 6) термометры; 7) скальпели; 8) пробочные сверла диаметром 6 мм; 9) пробирки; 10) микроскопы; 11) предметные стекла; 12) кисточки; 13) фильтровальная бумага.

Работа 12. Накопление сахаров в растениях при понижении температуры окружающей среды

ХОД РАБОТЫ

Растирают два клубня картофеля, один из которых выдержан в течение двух недель до проведения работы в холодильнике при температуре +1-2⁰С. Сок отжимают через марлю и фильтруют. При помощи универсального рефрактометра определяют коэффициент преломления и концентрацию сахара в % в фильтрате, пользуясь таблицами Н.А.Гусева.

Заполняют таблицу:

Вариант	Коэффициент преломления	Концентрация сахара в %
Клубни картофеля при комнатной температуре
Клубни из холодильника

Аналогичные процессы происходят и в древесных растениях (береза, клен и др.) весной, когда теплые дни сменяют холодные ночи и в период возврата холодов (краткосрочных заморозков).

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) клубни картофеля, хранившиеся обычно, и выдержанные две недели в холодильнике; 2) рефрактометр; 3) терка; 4) марля; 5) пипетка; 6) таблицы Н.А. Гусева.

Работа 13. Защитное действие сахара на белки протоплазмы при отрицательных температурах

При действии экстремальных температур белки коагулируют. Интенсивность выпадения хлопьевидного осадка из вытяжки растительной ткани - показатель ее повреждения. Сахароза стабилизирует активную структуру белка, тем самым, защищая его от губительного действия отрицательных температур.

ХОД РАБОТЫ

Очищенный клубень картофеля натирают на терке, переносят на двойной слой марли и отжимают через нее сок в коническую колбу, и дают отстоятся крахмалу. Надосадочную жидкость наливают в три пробирки по 2,5 мл в каждую. В первую пробирку добавляют 2,5 мл дистиллированной воды, во вторую - 2,5 мл 0,5 М сахарозы, в третью - 2,5 мл 1 М сахарозы. Перемешивают содержимое в пробирках и ставят в охладительную смесь на 20 минут (см. работу 11).

Отстаивают пробирки в стакане с водопроводной водой, не встряхивая, сравнивают образование хлопьев коагулирующего белка. Пробирки зарисовывают, делают выводы о защитном действии сахарозы при замерзании растительных тканей.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) клубни картофеля; 2) 0,5 М и 1 М растворы сахарозы; 3) снег и поваренная соль; 4) терка; 5) марля; 6) конические колбы; 7) пробирки; 8) пипетки на 10 мл; 9) термометры.

Работа 14. Определение морозостойкости по степени проницаемости протоплазмы для электролитов

При действии низких температур происходят различные изменения физико-химических свойств клеточных мембран, в частности повышается их проницаемость для электролитов (потеря главного свойства – полупроницаемости).

ХОД РАБОТЫ

Растения выращивают до фазы 2-3 листьев. Первый этап закаливания проводят в течение 7 дней при 2 °С, второй - в течение 3 дней при -4 °С. Промораживанию подвергают отрезки стебля длиной 1-1,5 см при -7, -9, -15°С в течении 6 часов. После промораживания берут три навески растений по 0,5 г (по каждому варианту), помещают в ячейки для определения электропроводности и наливают одновременно 50 мл дистиллированной воды. Продолжительность экстракции 4 часа при комнатной температуре.

В качестве контроля используют значение электропроводности раствора, полученного при экзоосмосе (выхода электролитов) из убитых при кипячении тканей стебля. Для этого одну навеску растений (0,5 г) каждого варианта кипятят в пробирках с дистиллированной водой в течение 10 минут. Затем вынимают из кипящей воды и помещают одновременно с исследуемыми образцами для экзоосмоса в ячейки 50 мл дистиллированной воды. Выход электролитов определяют по сопротивлению растворов при помощи реохордного моста или кондуктометра. Для анализа полученных результатов используют относительную электропроводность - процент от уровня экзоосмоса электролитов из тканей убитых при кипячении.

Результаты заносят в таблицу.

Вариант	Электропроводность при температуре			Выводы
	-7°С	-9°С	-15°С
1
2

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) растения 2-3 сортов, различающихся по устойчивости; 2) холодильные камеры; 3) весы; 4) пробирки; 5) реохордный мост или кондуктометр; 6) емкости для закаливания растений.

Работа 15. Определение жаростойкости растений (по Ф.Ф. Мацкову)

При повышении температуры выше оптимальной в растениях нарушается обмен веществ и, как следствие этого, накапливаются ядовитые вещества. При более высоких температурах резко повышается проницаемость цитоплазматических мембран, а затем наступает коагуляция белков и отмирание клеток.

Если подвергнуть лист действию высокой температуры, а затем погрузить в слабый раствор соляной кислоты, то поврежденные и мертвые клетки побуреют вследствие свободного проникновения в них кислоты, которая вызывает превращение хлорофилла в феофитин, тогда как неповрежденные клетки останутся зелеными. У растений, имеющих кислый клеточный сок, феофитинизация может произойти и без обработки соляной кислотой, так как при нарушении полупроницаемости мембран органические кислоты проникают из клеточного сока в хлоропласт, вытесняя магний из молекулы хлорофилла.

ХОД РАБОТЫ

Нагреть водяную баню до 40°С, погрузить в нее по 5 листьев исследуемых растений и выдержать листья в воде в течении 30 минут, поддерживая температуру на уровне 40°С. Затем взять первую пробу: вынуть по одному листу каждого вида растений и поместить их в чашку Петри с холодной водой (на чашке необходимо сделать соответствующую надпись). Поднять температуру в водяной бане до 50°С и через 10 минут после этого извлечь из бани еще по одному листу и перенести их в новую чашку с холодной водой. Так постепенно довести температуру до 80°С, беря пробы через каждые 10 минут при повышении температуры на 10°С.

Заменить воду в чашках 0,2 н соляной кислотой и через 20 минут учесть степень повреждения листа по количеству появившихся бурых пятен.

Результаты записать в таблицу, обозначив отсутствие бурения знаком слабое бурение - "+", побурение более 50% площади листа -"++" и сплошное побурение -"+++".

Объект	Степень повреждения листьев при
	40°С	50°С	60°С	70°С	80°С

Сделать выводы о степени жаростойкости исследованных растений.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) свежие листья каких-либо растений; 2) 0,2 н раствор соляной кислоты; 3) водяная баня; 4) термометр; 5) пинцет; 6) чашки Петри (5 шт.); 7) стакан с водой; 8) карандаш по стеклу.

Работа 16. Определение температурного порога коагуляции цитоплазмы (по П.А. Генкелю)

Клетки разных растений имеют различную жаростойкость. Температура, при которой в течение 10 минут происходит полная коагуляция белков цитоплазмы, считается условной границей жаростойкости растений. Гибель клеток устанавливается по потере или способности плазмолизироваться.

ХОД РАБОТЫ

Приготовить 12 срезов эпидермиса листа исследуемого растения и поместить по два среза в пробирки, в которые налито небольшое количество водопроводной воды.

Нагреть в большой колбе воду. Смешивая горячую воду с холодной приготовить в шести химических стаканах водяные бани с температурой 48, 50, 52, 54, 56 и 58°С (сделать на стаканах надписи карандашом по стеклу). Одновременно погрузить в водяные бани пробирки со срезами, поддерживая установленную температуру путем осторожного подливания в стаканы горячей воды. Через 10 минут извлечь срезы кисточкой из пробирок и перенести на предметные стекла, снабженные соответствующими надписями. Если клетки не содержат пигментов, следует окрасить их, выдержав в растворе нейтрального красного в течение 5-10 минут, затем отсосать раствор краски фильтровальной бумагой, нанести на срезы по капле 1 М раствора сахарозы, закрыть покровными стеклами и через 15-20 минут рассмотреть в микроскоп.

Записать результаты в таблицу, обозначая знаком "+" плазмолиз и знаком "-" его отсутствие. Каждый студент исследует один объект, а затем данные, полученные всей группой, записывают в таблицу.

Название растений	Температура, °С
	48	50	52	54	56	58

Сделать выводы, сопоставляя температурный порог коагуляции белков цитоплазмы различных растений.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) свежие листья различных растений; 2) 1М раствор сахарозы в капельнице; 3) 0,02%-ный раствор нейтрального красного; 4) стаканы химические большие (6 штук); 5) пробирки (5 штук); 6) большая колба; 7) электроплитка или газовая горелка с треножником; 8) термометр; 9) лезвие бритвы; 10) препаровальная игла; 11) кисточка; 12) микроскоп; 13) предметные и покровные стекла; 14) кусочки фильтровальной бумаги; 15) карандаш по стеклу.