Методичка

розчиняють 100 мг речовини у 100 мл води (концентрація 100 мг/л);

—абсцизини:

>АБК - абсцизова кислота;

розчиняють в 3 мл 70% етанолу, доводять водою до потрібного об'єму. Всі регулятори росту зберігають у холодильній камері при тем-

пературі +4°С або розливають по 3 - 5 мл і заморожують.

4. Розчини вітамінів:

тіамін НСІ (В!), піридоксин (В6), нікотинову кислоту (РР), аскорбінову кислоту (С), фолієву кислоту (В0), біотин (Н), параамінбензойну кислоту, Са-пантотенат, ціанкобаламін (Ві2), рибофлавін (В3) - розчиняють в воді (концентрація 1 мг/мл, або 0,1 мг/мл). Розчини вітамінів заморожують в невеликих об'ємах.

5. Вуглеводи і органічні добавки зважують і додають безпосередньо до середовища.

Схема приготування поживного середовища:

1.Наважку агару переносять в термостійку склянку, заливають половинним об'ємом (від об'єму середовища) бідистильованої або дистильованої води, залишають для набухання на 20 хвилин і нагрівають на плитці до 80 - 100°С постійно помішуючи.

2.В мірний циліндр наливають 100 - 150 мл бідистильованої або дистильованої води, додають точно відміряну кількість макрота мікроелементів, вітамінів, сахарозу та інші складові частини середовища.

3.Додають раніше приготовлений розчин агар-агару.

4.Середовище доводять до потрібного об'єму бідисгилятом (дистилятом).

5.Доводять рН середовища до потрібного значення, використовуючи ІнКОН.

6.Розливають тепле середовище у колби або пробірки, закривають ватними пробками або фольгою.

7.Середовища стерилізують автоклавуванням протягом 20 - 25 хвилин при тиску 1 атм.

8.При використанні термолабільних компонентів, їх стерилізують фільтруванням через мембранні фільтри (холодна стерилізація).

Склад середовищ, які найчастіше використовуються, наведені в таблиці 2.

12

				Таблиця 2.
Поживні середовища (концентрація речовин в мг/л)
	Мурасіге-	Гамборга	Уайта	Міллера
	Скуга(МС)
Макросолі	16500			10000
N H 4 N O 3		-	-
KN03	19000	2500	80	10000
СаС12-2Н2()	4400	150	-	- -
MgS04-7H20	3700	250	360	350
КН2Р04	1700	-	-	3000
NaH2P04*P[20	-	150	16,5	-
(NH)3S04	-	134	-	-
Ca(N03)2	-	-	200	3470
КС1	-	-	65	650
Na2S04	-	-	200	-
Мікросолі	620
H 3 B O 3		3,0	1,5	16,0
MnS04*4H>0	2230	10,0	4,5	44,0
CuS04*5H20	2,5	0,025		-
ZnS04*7H20	860	2,0	1,5	15,0
Na2Mo04*2H20	25	0,25	-	-
KI	83	0,75	0,75	0,8
CoCl2*6H2()	2,5	0,025	-
FeS04»7H20	557	28	28	17,8
Na2EDT02H20	745	37,3	37,3	37,2
Вітаміни
Bi	0,1	10	0,1	-
B6	0,5	1,0	0,1
PP	0,5	1,0	0,5
Сахароза	30000	20000	20000
Агар-агар	0,8 %	0,8%	0,8 %
pH	5,6-5,8	5,5	5,6-5,8

13

Робота 3. Одержання стерильних проростків (томатів, ріпаку, пшениці, цукрових буряків, соняшника)

Стерильні проростки вирощують з метою одержання експлантів для введення в калюсну культуру. Існує два можливих шляхи використання стерильних проростків: 1) для одержання експлантів із диференційованих тканин, які при перенесенні на поживне середовище, що містить фітогормони, дедиференціюються і в результаті інтенсивної проліферації утворюють калюсну тканину; 2) для одержання первинного калюсу безпосередньо на проростках, який може бути ізольований і перенесений в стерильних умовах на поживне середовище, що містить фітогормони, з метою подальшого культивування.

Мета роботи: отримання стерильних проростків для подальшої дедиференціації та отримання калюсної тканини.

Матеріали і обладнання: бокс для стерильних робіт з ламінарним потоком повітря, пінцети, розчин стерилізатору ("Білизна"), насіння, стерильні: фільтрувальний папір, дистильована вода, лабораторний посуд (чашки Петрі, стакани хімічні), поживні середовища; 70% розчин етанолу.

ХІД РОБОТИ:

1.Готують розчин стерилізатору. 1 частина "Білизни" і 2 частини стерильної дистильованої води.

2.Відбирають здорові, однакові насінини, ретельно промивають їх в мильному розчині, потім ополіскують водопровідною водою і дистильованою водою. Насіння поміщають в марлевий мішок.

3.Роботу проводять в ламінар-боксі. Насіння занурюють в 70% розчин етанолу. Потім у склянку із стерилізатором ("Білизна") занурюють насіння і залишають на 15 - 20 хвилин. Насіння тричі по 10 хвилин промивають стерильною дистильованою водою, обсушують на фільтрувальному папері і розміщують в чашки Петрі на поживне середовище.

Склад поживного середовища для пророщування проростків (мг/л):

Макросолі МС	50 мл
Мікросолі МС	0,5 мл
Fe-хвлат	5 мл
Вітаміни МС	0,5мл
Сахароза	20 г
Агар-агар	8г
рН 5,6-5,8

14

4.Чашки Петрі закривають парафільмом і ставлять до термостату для пророщування насіння та отримання стерильних проростків (температура +23 - 25°С, абсолютна темрява). Через 3 - 4 доби перевіряють чистоту посіву.

										Таблиця 3.
				Кількість ін-			Схожість				Ефектив-
Насіння	Концентрація	Тривалість	Загальна	фікованого			насіння				ність сте-
				насіння через							риліза-ції
	розчину "Бі-	стерилі-	кількість
				7 діб							(%)
	лизни"	зації (хв)	насіння
				штук		%	штук		%

Тема II. КУЛЬТУРА КАЛЮСНИХ ТКАНИН

Калюсні клітини невизначено довго вирощують в умовах in vitro. Для цього необхідні періодичні пересадки (пасажі) невеликої частини утворених клітин на свіже поживне середовище через кожні 3 - 4 тижні. Найбільш „старим" вважають штам клітин, одержаний з коренеплоду моркви Роже Готре в 1938 p., і який на сьогоднішній день вирощують у багатьох лабораторіях світу. Калюсні тканини - це дедиференційовані клітини, в які перетворюються спеціалізовані і меристематичні клітини при їх культивуванні на специфічних поживних середовищах in vitro, Калюсна тканина має вигляд аморфної маси тонкостінних паренхімних клітин без визначеної анатомічної структури. Клітини калюсу мають велике ядро, високий вміст ДНК і РНК. Деякі клітини здатні накопичувати крохмаль і речовини вторинного метаболізму. Колір тканин може бути білим, жовтим, зеленуватим, червонуватим, що залежить від виду рослини, типу експланта, умов культивування.

Утворення калюсу проходить в області первинних або вторинних меристем, а також із паренхіми, яка прилягає до цих меристем або до вторинних судинних тканин. Цей процес залежить від розміру експланта та його складових клітин. Чим більший експлант, тим більш складні відносини між основною тканиною фрагменту та клітинами, які дають початок росту калюсу.

Для індукування калюсної тканини стерильні листки, черешки, сегменти стебла нарізають і поміщають на поживне середовище. Калюсну тканину можна індукувати із будь-якого органу тканини рослини (успіх залежить від виду рослини ta тканини). При цьому клітини рослин, які знаходяться на крайній стадії диференціації, під дією

15

індукторів клітинного розмноження - ауксинів та цитокі нінів, переходять в дедиференційований стан і відновлюють меристематичну активність. Після утворення калюсу в асептичних умовах, його відділяють і поміщають на нове агаризоване поживне середовише, отримують стерильну культуру калюсної тканини, яку можна підгримувати в культурі необмежено довгий час, періодично розділяючи на фрагменти і пересаджуючи на нове середовище. Для індукції кал юсоутворення необхідно використовувати поживні середовища з високим (до 10 кратного) співвідношенням ауксин: цитокінін. З калюсної тканини на певному поживному середовищі можна отримати окремі органи рослин (корені, пагони, листки) або зародкоподібні структури.

Робота 4, Одержання і культивування калюснсї тканини з листків тютюну

Отримання калюсної тканини можливе із різних частин рослин, в тому числі із зелених листків. Проте і тоді, коли вихідним матеріалом для калюсоутворення є зелені клітини листка, а також при умові культивування їх на світлі, калюсна тканина, яка виникла після дедиференціювання в більшості випадків втрачає зелене забарвлення і здатність до фотосинтезу. Дедиференціюванню клітин та переходу до калюсогенезу сприяє пошкодження тканин, тому листки для кращого утворення калюсу попередньо надрізають.

У залежності від походження і умов культивування калюсні тканини бувають рихлими, крихкими^ компактними, середньої щільності з добре вираженими меристематичнимй осередками.

Мета роботи: отримати калюсні тканини для вивчення закономірностей росту частин пластинки молодого листка, а також для отримання калюсної тканини за рахунок дедиференціації клітин паренхіми.

Матеріали і обладнання: ламінар-боксй, інструменти 'ланцети, пінцети), спиртівка, чашки Петрі, флакони з поживним середовищем, стерильні рослини тютюну.

ХІД РОБОТИ:

1.Роботу проводять в ламінар-боксі. Стерильні листки поміщають у чашку Петрі, нарізають невеликими шматочками.

2.Експланти поміщають на поживне середовище, яко містить:

Макросалі МС	100 мл
Мікросолі МС	1 мл
Fe-хєлат	5 мл
Вітаміни Уайта	1 мл

16

2,4-Д	0,5 мг/л
ІОК	2,0 мг/л
Кін	0,5 мг/л
Сахароза	20 г
Агар-агар	8г

рН 5,6-5,8 до автоклавування

3.Для отримання калюсної тканини флакони з листковими пластинками поміщають в термостат при температурі 4-2 5 °С, абсолютній темряві, вологості 70%.

Робота 5, Одержання і культивування калюсної тканини із коренеплодів моркви

Мета роботи: отримання калюсної тканини моркви та картоплі і використання її для подальшого субкультивування.

Матеріали і обладнання: ламінар-бокс, інструменти (пінцети, ланцети, свердла), чашки Петрі, флакони з поживним середовищем, мильний розчин, дистильована вода, спирт етиловий 96°, фарфорові склянки.

ХІД РОБОТИ:

1.Використовують здорові, не пошкоджені бульбота коренеплоди, які зберігалися при температурі +4°С. їх ретельно миють мильним розчином за допомогою щітки, промивають проточною во^ою, споліскують дистилятом, потім очищують.

2.Подальшу роботу проводять в ламінар-боксі: коренеплід або бульбу наколюють на стерильний ланцет і опускають у фарфорову склянку з 96° етиловим спиртом, потім обпалюють в полум'ї спиртівіси.

3.За допомогою стерильного свердла з них вичленяють циліндри тканин, поміщають у чашку Петрі, відсікають обпалені краї і нарізають на диски шириною 1,5 - 2,0 мм.

4.Ізольовану тканину поміщають у флакони на калюсогенне поживне с гредовище, склад якого:

Макросолі МС	100 мл
Мікросолі МС	1 мл
Fe - хелат	5 мл
Вітаміни МС	1 мл
Гідролізат казеїну	500 мг
Мезоінозит	100 мг

17

Кінетин	0,2 мг/л
ЮК	2 мг/л
Сахароза	20 г
Агар-агар	8г

рН 5,6-5,8 до автоклавування

5.Ізольовані тканини поміщають у термостат (абсолютна темрява, температура +25 - 26°С) для отримання калюсної тканини.

6.Розглядають і замальовують експланти через 7 діб. Зазвичай через 7 - 1 0 діб вони втрачають зелене забарвлення і стає помітним утворення калюсної тканин (спочатку по краям надрізів, а потім по всій поверхні листкової пластинки). Через 3 тижні можна спостерігати добре розвинені калюси.

Робота 6, Одержання і культивування калюсу із різних експлантів стерильних проростків соняшника, ріпаку, пшениці, цукрових буряків

У відповідь на поранення паренхімні клітини, які перенесені на поживне середовище, що містить фітогормони, дедиференціюються, переходять до ділення і утворюють недиференційовану тканиниу - калюс. Калюс може бути одержаний із різних органів рослини, зокрема, у картоплі - із тканин стебла, листків, мікробульб, пиляків. В залежності від умов культивування і походження калюсні тканини бувають рихлими, крихкими, компактними, середньої щільності з добре вираженими меристематичними осередками.

Мета роботи: отримання калюсних тканин соняшника, ріпаку, пшениці, цукрових буряків і використання їх для подальшого субкультивування.

Матеріали і обладнання: ламінар-бокс, інструменти (пінцети, ланцети), чашки Петрі, флакони з поживним середовищем, стерильні рослини в пробірці, спирт етиловий 96°, фарфорові склянки.

ХІД РОБОТИ:

1.Пробірку із стерильною рослиною протирають спиртом, обпалюють над полум'ям спиртівки.

2.Пінцетом виймають стерильну рослину із пробірки і поміщають в стерильну чашку Петрі.

3.Підтримуючи рослину пінцетом, скальпелем розрізають її на експланти: стебло (довжиною 5 - 1 0 мм), листки. На експлантах роблять додаткові надрізи для появи в подальшому раневого калюсу.

18

4.Експланти поміщають у флакони з калюсогенним поживним середовищем.

Склад поживного середовища для культивування калюсної тканини із різних експлантів

ПШЕНИЦІ		СОНЯШНИКА
МакроМС	100 мл	МакроМС	100мл
Мікро МС	1 мл	Мікро МС	1 мл
Вітаміни МС	Імл	Вітаміни МС	Імл
Fe-хвлат	5 мл	Fe-хвлат	5мл
Мезоінозит	ЮОмг	Мезоінозит	ЮОмг
2,4-Д	3,0 мг/л	2,4-Д	4,0 мг/л
6-БАП	0,5 мг/л	6-БАП	1,0мг/л
Сахароза	30 г	Сахароза	30г
Агар-агар	8 г	Агар-агар	8 г
РІПАКУ		ЦУКРОВИХ БУРЯКІВ
Макро МС	100 мл	МакроМС	100мл
Мікро МС	1 мл	Мікро МС	І мл
Вітаміни МС	Гмл	Вітаміни МС	1 мл
Ге-хелат	5 мл	Fe-хвлат	5мл
Аденін	10 мг/л	Мезоінозит	ЮОмг
ГК	0,05 мг/л	Гліцин	2мг/л
6-БАП	0,5 мг/л	6-БАП	1 мг/л
НОК	0,5 мг/л	Сахароза	30г
Сахароза	20г	Агар-агар	8 г
Агар-агар	8 г

5.Флакони з рослинним матеріалом поміщають у темнову культуральну кімнату при температурі 22 -25°С і вологості 70%.

6.Через 14 днів проводять візуальне визначення частоти калюсоутворення на експлантах. Результати заносять у таблицю.

					Таблиця 4.
№	Тип екс-	Загальна	Кількість експлантів,		Індекс
п/п	планта	кількість	що утворили калюс.		росту
		експлантів	штук	%

19

Робота 7. Субкультивування калюсної тканини ріпаку, пшениці, цукрових буряків, соняшника на свіже поживне середовище

Крива росту калюсної тканини носить S-подібкий характер. Вона складається із початкової фази (лаг-фази), фази логаріфмічного росту, під час якої відбувається активне ділення клітин, фази сповільненого росту, стаціонарної фази і фази деградації. Для того, щоб зберегти здатність до ділення і подальшого росту, шматочок калюсної тканини переносять на свіже поживне середовище. Цей прийом підтримки клітинного ділення носить назву пасажувс ння тканини. Пасажу вати тканини можна необмежено багато раз. Але при багаторазовому пасажуванні тканин на свіже поживне середовище спостерігається явище "звикання", яке виражається в набутті автономності по відношенню до гормонів та втраті або значному послабленню здатності калюсних тканин до регенерації цілої рослини.

Мета роботи: перенесення калюсної тканини на свіже поживне середовище.

Матеріали і обладнання: культура калюсної тканини соняшника, ріпаку, пшениці, цукрових буряків, флакони із стерильним поживним середовищем, стерильні пінцети, скальпелі, стерильні чашки Петрі.

ХІД РОБОТИ:

1.Переносять первинний калюс із флакону в стерильну чашку Петрі.

2.Відокремлюють старі некротизовані ділянки та шматочки агаризованого середовища.

3.Калюсну тканину розділяють на рівні шматочки.

4.Шматочки калюсу асептично переносять у флакони із стерильним калюсогенним поживним середовищем. Шматочки необхідно дещо вдавити пінцетом в агар.

5.Флакони поміщають в термостат з температурою +25°С і вологості повітря 60% на 3 - 4 тижні. Потім проводять зняття ростових характеристик утворених калюсних тканин.

Робота 8. Реєстрація ростових характеристик калюсних тканин

Інтенсивність росту окремих калюсів одного й того ж варіанту може варіювати. Варіабельність її залежить від того, що інокулюми беруть з різних ділянок вихідного калюсу та з різних калюсів, а тому окремі варіанти дослідів з калюсними культурами повинні мати не менше шести повторностей.

20

Для обліку калюсних тканин використовують якісні та кількісні критерії. Якіс на оцінка застосовується при вивченні процесів органогенезу в недиференційованій культурі тканин і кореляцій між органами при їх утв оренні. Кількісні критерії використовують при вивченні дії на ріст культури різних зовнішніх факторів.

Мета роботи: визначення приросту сирої маси калюсу картоплі. Матеріали і обладнання: флакони з калюсною тканиною, терези.

ХІД РОБОТИ:

1.Спеціально для зважування за два тижні до проведення заняття проводять додаткове пасажування калюсу на поживні середовища.

2.В момент обліку калюси витягують із флаконів і формують із них по черзі "копії"" такого ж розміру і форми, що і калюси в дослідних флаконах.

3.Одержані "копії" зважують в нестерильних умовах.

4.Один і гой же калюс може бути використаний для одержання декількох "копій".

5.Приріст тканин за певний проміжок часу підраховується за формулою

AW — приріст тканини за певний проміжок часу, %; Wt — кінцева вага культури, г;

W0-—початкова вага культури, г.

Якщо тривалість росту в окремих варіантах неоднакова, необхідно ввести в формулу фактор часу

Тема III. ВИ ЗНАЧЕННЯ ЦИТОКІНІНОВОЇ ТА АУКСИНОВОЇ

АКТИВНОСТІ ФІТОРЕГУЛЯТОРІВ

Важливим елементом дії фітогормонів на рослини є їх вплив на генетичний апарат рослин. На сучасному етапі відомо, що цей вплив реалізується за рахунок стимулювання експресії ряду7 гормональних генів та за рахунок загального зменшення рівня метилювання ДНК.

Регулятори росту рослин - це група природних і синтетичних органічних сполук, які в невеликих кількостях впливають на обмін речовин вшщ х рослин, що призводить до значних змін в їх рості і розвитку. Реіулятори росту природного походження - продукти життєдіяльності мікроорганізмів або самих рослин, називають ендо-

21