Методичка

ророзмноження рослин. Він базується на здатності ізольованих частин рослин при певних умовах поживного середовища відновлювати органи і тим самим одержувати цілі рослини. Утворення адвентивних бруньок можна індукувати на будь-яких органах і тканинах рослин (ізольований зародок, листок, сім 'ядолі, стебло, луски луковиць, сегментів кореней і зародків суцвіть). Цей процес, як правило, відбувається на поживному середовищі, яке містить один цитокінін або в поєднанні з ауксином. В якості цитокінінів використовують 6-БАП, кінетин або зеатин, а із групи аукснів - ЮК або НОК. Адвентивні бруньки після їх відокремлення від первинного експланта і самостійному культивуванні на безгормональному середовищі або середовищі, яке містить невисокі концентрації цитокініна, формують пагони, здатні в подальшому до укорінення.

Мета роботи: одержати адвентивні бруньки безпосеред ньо на гіпокотильних сегментах стерильних проростків соняшника Матеріали і обладнання: 5-добові пробірочні рослини соняшника,

пробірки із стерильним поживним середовищем, пінцет, скальпель, спиртівка, 96%-вий спирт.

ХІД РОБОТИ:

1.Стерильним інструментом виймають рослини соняшнику із пробірки і поміщають у сїерильну чашку Петрі.

2.Скальпелем вирізають гіпокотильну зону проростка, після чого ділять її на сегменти розміром 0,4 - 0,5 см.

3.Одержані сегменти стерильним пінцетом переносять на поживне середовище в пробірки.

Макросолі МС	ІООмл
Мікросолі МС	1	мл
Вітаміни МС	Імл
Fe-хвлат	5 мл
6-БАП	4,0	мг/л
ЮК	0,5	мг/л
Сахароза	30 г
Агар-агар	8г

рН 5,6-5,8 до автоклавування

4.Пробірки з рослинним матеріалом поміщають в світлову кімнату, де підтримують 16-годинний фотоперіод, температуру 22 - 25 °С.

42

5. Через 4 - 6 тижні фіксують утворення адвентивних бруньок і одержані результати записують в зошит.

Робота 23. Реєстрація ростових характеристик рослинрегенерантів

Для обл іку рослин-регенерантів використовують такі показники:

1.Сира та суха вага рослин-регенерантів. Визначають їх в кінці досліду або через кожні 7 днів протягом періоду росту - для визначення динаміки росту рослин-регенерантів.

2.Кількість міжвузлів та їх довжину.

3.Індекс росту (відношення кінцевої довжини рослини-регене- ранту до величини вихідного експланта).

4.Площу листкової поверхні.

5.Коефіцієнт розмноження, який показує кількість рослинрегенерантів, які можна отримати з одного експланта за певний проміжок часу.

Робота 24. Адаптація пробірочних рослин до ґрунтових умов вирощування

Пересадка рослин-регенерантів у субстрат е відповідальним етапом, який завершує процес клонального мікророзмноження. Найбільш спрттливий час для пересадки пробірочних рослин - весна або початок літа. Не рекомендується затримувати рослини в стерильній культурі, тому що це негативно відбивається на приживанні і подальшому рості регенерантів. В промисловості для отримання однорідного посадкового матеріалу рекомендують відсортовувати рослини: великі, середні і невеликі рослини, які висаджують окремо.

Мета роботи: провести адаптацію рослин-регенерантів.

Матеріали та обладнання: рослини-регенеранти, пінцети, субстрат, розчини макросолей, мікросолей.

ХІД РОБОТИ:

1.Рослини -регенеранти з двома - трьома листками і добре розвиненою кореневою системою обережно виймають пінцетом. Відмивають коріння від залишків агару.

2.Висаджують рослини в посудини з субстратом. В основному використовують суміїїі торфу, піску, перліту (1:1:1), який попередньо с терилізують при 85 - 90°С протягом 1 - 2 годин.

3.Культивують рослини-регенеранти при температурі 22 - 25°С і вологості 80-90%.

43

4.Через 20 — 30 днів після посадки рослини, які вкорінилися підкормлюють розчинами Мурасіге-Скуга або Кнудсона.

5.По мірі росту рослин, їх висаджують в свіжий субстрат в більші ємкості. Як субстрат можна використати суміш торфу і піску (3:1) або суміш торфу, дернового грунту, перліту (1:1:1).

РОЗДІЛ 2. МОЛЕКУЛЯРНА БІОЛОГІЯ І ГЕНЕТИЧНА ІНЖЕНЕРІЯ

Генетичну інженерію складає система прийомів, які дозволяють лабораторним шляхом конструювати штучні генетичні структури у вигляді рекомбінантних (гібридних) молекул ДНК. Суть генетичної інженерії полягає в переміщені окремих генів із одного генетичного оточення в інше; що призводить до різних фенотипових змін в клітині.

Основними проблемами генетичної інженерії є:

1.Вибір векторів і експресія чужерідних генів, тобто вирішення питання про те, як індукувати або регулювати експресію чужерідних генів в рослинній клітині.

2.Отримання в кінцевому результаті нормальних здорових рослин, здатних до розмноження.

3.Вибір і виділення генів рослинного або іншого походження,

введення яких призводить до появи нових помітних змін у рослин.

Основні етапи генетичної інженерії зводяться до того, що із набору рестрикційних фрагментів ДНК, які містять потрібний ген, збирається компактна генетична структура - ДНК, яка потім вводиться в

клітину. Нова генетична інформація експресується, що призводить до синтезу відповідного продукту, який кодується клонуючим геном. Таким чином, вводячи в клітину нову генетичну інформацію в вигляді гібридних молекул ДНК, можна отримати рослину, яка буде змінена відповідно поставленій меті.

Тема VIII. БУДОВА І ВЛАСТИВОСТІ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ

Робота 25. Виділення плазмідної ДНК із бактеріальних клітин

Основна маса клітинної ДНК бактерій міститься в хромосомі (в хромосомі Escherichia coli, наприклад, біля 4 млн.н.п.). Крім того, є багато кільцевих молекул ДНК довжиною в декілька тисяч пар основ. Такі мініхромосоми називаються плазмідами. В їх складі часто бувають гени стійкості до токсинів і антибіотиків. Завдяки високої копійності плазмід клітина синтезує велику кількість ферментів, які нейтралізують дію антибіотиків.

44

В присутності іонів кальцію плазміди легко поглинаються бактеріями, і в бактеріальних клітинах виявляється багато копій поглинутих плазмід, так як вони мають власний реплікативний апарат і можуть реплікуватися незалежно від хромосомної ДНК. Дані властивості дозволяють використовувати плазміди в якості векторів в експериментах з генетичної інженерії. Векторами називають молекули, які допомогають чужерідній ДНК проникнути в клітину і забезпечують її інтеграцію в геном реципієнта або автономну реплікацію. Таким чином, виділення плазмідної ДНК знаходить широке використання в генетичній інженерії.

Процес виділення плазмідної ДНК можна розділити на З основні етапи: 1) руйнування (лізис) бактеріальних клітин; 2) відокремлення плазмідної ДНК від хромосомної; 3) очистка плазмідної ДНК від РНК і білків клітини.

Лізис клітин здійснюється за допомогою ферменту лізоцима. Розділення плазмідної і хромосомної ДНК відбувається в результаті денатурації і наступної ренатурації. Хромосомна ДНК представлена у вигляді лінійних фрагментів, а плазмідна — у вигляді ковалентно замкнутих кільцевих молекул; і при денатурації ланцюги лінійних фрагментів ДНК розділяються і розходяться в просторі, а ланцюги кільцевих молекул розійтись не можуть, так як вони з'єднані в звивчаті замкнуті лінії. При ренатурації (процесі відновлення подвійної спіралі) кільцеві молекули стають дволанцюговими практично миттєво, а фрагменти хромосомної ДНК залишаються одноланцюговими, так як їм необхідно час, щоб знайти один одного в просторі. Ці фрагменти зв'язуються з детергентом (натрій додецил сульфат - НДС) і переходять в нерозчинну фракцію, яку легко відокремити центрифугуванням. Кільцеві молекули ДНК при цьому залишаються в розчині. Молекули РНК гідролізують за допомогою фермента РНКази. Очистку від білків проводять, додаючи фенол і (або) хлороформ, під дією яких вони коагулюють і стають нерозчинними.

Мета роботи: виділити плазмідну ДНК із бактеріальних клітин. Матеріали і обладнання: буфер для лізису, лізоцим, розчин для денатурації, З М розчин ацетату натрія (рН 4,8), ізопропанол, етанол, ТЕ-буфер, РНКаза, фенол, хлороформ, 5 М розчин NaCl, пробірки, автоматичні мікропіпетки, центрифуга Епендорф, нічна культура клітин Е. соїі (титр 109), льодяна баня.

ХІД РОБОТИ:

1. 1,5 мл нічної культури переносять в пробірку, охолоджують на водяній бані центрифугують протягом 3 хв при 8000 g, ретельно

45