[Мікробіологія] Лекції / #3 med Генетика
.pdfФаготипирование бактерий
1.засев газоном на пластинчатый агар изучаемого штамма
2.нанесение капель типовых фагов
3.инкубация
4.регистрация «стерильных пятен» («бляшек»)
5.фаготип (фаговар) = перечень типовых фагов, лизирующих данный вариант
Методы, основанные на гибридизации
нуклеиновых кислот
Цель
Выявление степени сходства различных ДНК (при идентификации микроорганизмов – сравнение ДНК выделенного штамма с ДНК эталонного штамма)
Молекулярная гибридизация – метод,
основанный на способности одноцепочечной молекулы изучаемой ДНК/РНК специфически соединяться с комплементарными одноцепочечными зондами (молекулами-
свидетелями) с образованием гибридных дуплексов, которые флюоресцируют или меняют цвет реакционной смеси.
МЕТОД МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ
Принцип осуществления
исследуемая ДНК
нагрев в щелочной среде
расплетение на две отдельные нити
закрепление одной из них на специальном фильтре
помещение этого фильтра в р-р, содержащий известный радиоактивный или флюоресцентный зонд (оц ДНК эталонного
штамма, меченную рад. изотопом или флюор.кр.)
понижение температуры
+восстановление двойной спирали
–двойная спираль не восстанавливается
DNA-DNA hybridization
Strain 1
Heat
+ |
Strain 2 |
0% Homology |
100% Homology |
|
МЕТОД МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ
КРИМИНАЛИСТИКА И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТЦОВСТВА
DNA microarray - ДНК-микрочип
Пластина с нанесенными на нее в определенном порядке фрагментами ДНК известной последовательности. ДНКмикрочипы могут одновременно измерить экспрессию десятков тысяч генов у человека и выявить около миллиона мутаций.
DNA microarray - ДНК-микрочип
Активная работа гена в ткани выражается в накоплении его матричной РНК (мРНК). Все мРНК экстрагируются из образца ткани, и с помощью фермента обратной транскриптазы на них синтезируется т.н. комплементарная ДНК (кДНК), которая значительно устойчивей и удобней в работе, чем мРНК.
Микрочип для
40000 проб
•Полученный набор кДНК метят с помощью флуоресцентных или радиоизотопных меток. Содержание индивидуальных кДНК в образце прямо пропорционально содержанию их мРНКматриц и, следовательно, уровню активности соответствующих генов.
•Смесь кДНК наносят на микрочип, в каждой точке которого пришиты ДНК-фрагменты, соответствующие кодирующей последовательности одного из генов. кДНК находят «свои» точки и связываются (гибридизуются) с ними по принципу комплементарности. Чем больше в растворе кДНК данного вида, тем больше ее прикрепляется к своей точке. Затем специальное сканирующее устройство определяет содержание кДНК в каждой точке микрочипа, а программа соотносит его с названием гена, представленного данной точкой.
• |
Результатом исследования является матрица из |
|||
|
точек, |
интенсивность |
которых |
прямо |
пропорциональна активности соответствующих генов.
Какие гены работают
в опухолевых клетках? Normal cell
Known gene |
Cy3 dye |
sequences |
|
Isolation RNA |
Glass slide (chip) |
Cy5 dye |
YELLOW - если ген экспрессируется и в больной (Cy5) и в нормальной
(Cy3) тканях, то в данном пятне будет гибридизоваться ДНК, меченная
и красной и зеленой красками, и в результате получится желтый цвет Cancer cell
RED - если ген экспрессируется только в больной (Cy5) ткани, то в данном пятне будет гибридизоваться только ДНК, меченная красной краской
GREEN - если ген экспрессируется только в здоровой (Cy3) ткани, то в данном пятне будет гибридизоваться только ДНК, меченная зеленой краской
BLACK – если ген не экспрессируется ни в больной, ни в здоровой ткани
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Цели
•обнаружение в патологическом материале конкретного вида
микроорганизма без выделения чистой культуры
•идентификация микроорганизмов
•генотипирование микроорганизмов
Праймеры для ПЦР
Праймер (англ. primer) — это короткий фрагмент НК, который служит стартовой точкой при репликации ДНК. Праймеры необходимы ДНК-полимеразам, так как ДНК-полимеразы могут только наращивать существующую цепь.
•Создание своих праймеров
•Программы: PrimerSelect (DNASTAR), Oligo
•Необходимо знать последовательность (генбанк)