[Мікробіологія] Лекції / #3 med Генетика
.pdf
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Принцип осуществления
патологический материал или штамм микроорганизма
выделение ДНК
нагрев
расплетение ДНК на две нити
добавление праймеров (участки ДНК, комплементарные 3’- концам искомого гена)
охлаждение
связывание праймеров с комплементарными участками искомого гена
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Принцип осуществления
добавление ДНК-полимеразы и нуклеотидов
нуклеотиды присоединяются к 3’-концам праймеров
повторение циклов (30-80) – накопление (амплификация) искомого гена
резкое нарастание (двукратное после каждого цикла) количества искомого гена
определение количества ДНК с помощью электрофореза
+количество ДНК увеличивается
–количество ДНК не увеличивается
•Выделенная ДНК
•Буфер
•Mg
•dNTPs (dA, dC, dT, dG)
•Термостойкая ДНКполимераза –
-Taq-полимераза -
Thermus aquaticus
-Pfu-полимераза -
Pyrococcus furiosus
-Pwo-полимераза-
Pyrococcus woesei
•Праймеры («туда и обратно») – cпецифичность реакции
•Амплификатор
Методы, основанные на определении последовательности нуклеотидов в ДНК, РНК и аминокислот в белках.
Секвенирование – метод, позволяющий определять последовательность нуклеотидов – аденина, тимина, гуанина, цитозина – в молекуле ДНК. Использование этого метода позволило секвенировать геномы человека, животных, растений, микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов).
Цели секвенирования:
1.расшифровка генома – определение количества генов, их протяжённости, локализации, функций;
2.идентификация неизвестных микроорганизмов путем сравнения нуклеотидной структуры некоторых их генов с соответствующими последовательностями известных видов;
3.определение мутаций в генах;
4.эпидемиологические исследования (определение генетических различий штаммов одного вида, выделяемых в разное время и из разных источников;
5.выявления направлений эволюции микроорганизмов. На основании секвенированных последовательностей строят дендрограммы, позволяющие оценивать сходство микроорганизмов и их происхождение.