Тема 8.3. Микрофлора организма человека

План

Программа

Особенности и основные понятия экологии микроор­ганизмов.

Качественные и количественные методы изучения со­става микрофлоры отдельных биотопов.

Значение нормальной микрофлоры в жизни человека.

Микробиологическое исследование при дисбактериозе.

а Демонстрация

Окрашенные мазки, приготовление из чистых культур бактерий, представителей облигатной микрофлоры че­ловека. Рост на скошенном агаре E.coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus epidermidis.

Микрофлора зубного налета.

Задание студентам

1. Приготовить мазки из зубного налета, микроскопиро-вать и зарисовать; сделать заключение.

кровяной агар, для выделения E.coli— на среду Эндо, для вы­деления дрожжеподобных грибов рода Candida — на среду Са-буро. Посевы производят таким образом, чтобы получить со­считываемое количество колоний. Такие исследования повто­ряют через определенные сроки, чтобы сделать заключение о количественных изменениях состава микрофлоры в динамике заболевания (табл. 8.3.1).

Таблица 8.3.1. Состав нормальной, резидентной микрофлоры биото­пов организма человека

Микрофлора биотопа

Ориентировочное содержание микробов

Кровь, лимфа, внутренние органы, головной и спинной мозг, спинномозговая жидкость

г—сравнительно часто встречаются: i Vaphylococcus epidermidis \saprophyticus (+) А пеЬас1епит spp. (+) А rtococcus spp. (+) А Г/Ля fo. (+) А зрр. А mas aeruginosa (-) А

1ечный тракт ^благоприятные условия для

йикрофлоры:

ъиз salivarius,

mitis, S. mutatis, S.sanguis (+) A Lactobacillus spp. (+) ah Bifidobacterium spp. (+) ah Leptotrichia buccalis (—) Veilonella spp. (—) ah Bacteroides spp. (-) ah Candida spp. A Treponema skoliodontum, T.denticola (—) A Neissena spp. (-) A Mycoplasma spp. A Staphylococcus spp. (+) A

Желудок — многие микроорганизмы погиба­ют при кислом значении рН, встречаются:

Sarcina ventriculi (+) А

Lactobacillus spp. (+) А

Candida spp. A

Тонкая кишка — в верхних отделах кишки микрофлора представлена скудно в связи с активностью ферментов. Число микроорга­низмов постепенно нарастает в илеоцекальном отделе

В норме не содержат микробов и являются стерильными

10²-10⁴ на 1 см³

10⁸ в 1 мл слюны

Не более 10³ в 1 мл содержимого

Около 10⁵ в 1 мл со­держимого

Продолжение

Микрофлора биотопа

Ориентировочное содержание микробов

Толстая кишка — благоприятные условия для 10¹⁰ в 1 г фекалий

разнообразной микрофлоры, выделяются с

фекалиями:

Анаэробы (в совокупности)

Bacteroides spp. (—)

Bifidobacterium spp. (+)

Lactobacillus spp. (+)

Clostridium spp. (+)

Veilonella spp. (—) Аэробы

E.coli и др. энтеробактерии (—)

Streptococcus faecalis (+)

Bacillus spp. (+)

Конъюнктива глаза — очень часто микроор­ганизмы полностью отсутствуют, могут встре­чаться:

Staphylococcus epidermidis (+) А

Corynebacterium spp. (+) А

Уши (наружный слуховой проход) — факуль­тативно встречаются:

Staphylococcus epidermidis (+) А

Corynebacterium spp. (+) А

Candida spp. A

Дыхательная система (верхние дыхательные пути)

Staphylococcus saprophyticus (+) А

Streptococcus spp. (+) А

Klebsiella spp. (—) A

Neisseria catarralis (-) A Candida spp. и др.

Мелкие бронхи, альвеолы и паренхима легких обычно не содержат микробов Мочеполовая система

Число микробов в со­вокупности составля­ет 10¹⁰ в 1 мл влага­лищного секрета. Со­отношение анаэробов к аэробам 10:1

Стерильна

Женские половые органы (влагалище и шей­ка матки)

Lactobacillus spp. (+) ан

Corynebacterium spp.

(+)Ан

Peptococcus spp.

Полость матки —

Мужские половые органы

Mycobacterium smegmatis (+) А

Corynebacterium spp. (+) А

Staphylococcus epidermidis (+) A

и др.

Микрофлора биотопа Ориентировочное содержание микробов

Дистальная треть уретры (женщин и муж­чин) Peptostreptococcus spp. (+) ан Peptococcus spp. (+) ан Corynebacterium spp, (+) A Mycoplasma hominis A Staphylococcus epidermidis (+) A

Моча в почках, мочеточниках и мочевом пу- Стерильна зыре При естественном мочеиспускании микробы Число микробов не попадают в мочу с наружного участка уретры должно превышать 10³ КОЕ/мл

Бактериологическое исследование трупов павших жи­вотных.

Методы изучения факторов вирулентности бактерий:

а) изучение взаимодействия лиганд-рецепторного ап­парата;

б) определение токсигенности микробов;

в) определение ферментов патогенности.

5. Особенности вирусных инфекций.

а Демонстрация

Капсула патогенных бактерий; окраска по методу Бурри—Гинса.

Корд-фактор Mycobacterium tuberculosis (метод Прайса); окраска по методу Циля—Нильсена.

а Задание студентам

Зарисовать демонстрируемые препараты: а) капсулу патогенных бактерий; б) корд-фактор М.tuberculosis.

Микроскопировать и зарисовать окрашенные метиленовым синим мазки-отпечатки из органов белой мы­ши, павшей после заражения культурой патогенных бактерий. Определить присутствие бактерий во внут­ренних органах и тканях. Сделать заключение о форме инфекции и возможных причинах гибели животного.

Микроскопировать мазок со слизистой оболочки, ок­рашенный по методу Романовского—Гимзы. Найти и зарисовать "ключевые" клетки, покрытые адгезированными бактериями.

Микроскопировать и зарисовать мазок, демонстрирующий явление незавершенного фагоцитоза гонококков; окраска по методу Грама.

Учесть результаты опытов, поставленных с целью вы­явления факторов вирулентности стафилококков: ге­молизина, лецитиназы, плазмокоагулазы.

Определить гемолитическую активность бактериаль­ного экзотоксина (О-стрептолизина).

а Методические указания

Бактериоскопические методы выявления факторов вирулент­ности. Обнаружение капсулы у стрептококков (см. тему 2.2).

Выявление корд-фактора микобактерий. При выра­щивании микобактерий на предметных стеклах, погруженных в жидкую среду на основе цитратной крови, вирулентные штаммы вырастают в виде переплетающихся тяжей — корд-фактор. Для их обнаружения стекла окрашивают по методу Циля—Нильсена (см. рис. 14.3.2).

Выявление адгезии бактерий. При некоторых инфек­циях бактерии в большом количестве прикрепляются к мембране эпителиальных клеток. Обнаружить это явление можно с помощью микроскопических методов в мазках со слизистой оболочки пораженного органа, окрашенных по методу Рома­новского— Гимзы. Такие клетки получили название ключевых.

Выявление незавершенного фагоцитоза (см. рис. 15.2.1). При микроскопии наблюдается большое количество неразрушенных микроорганизмов, расположенных внутри про­фессиональных фагоцитов.

Определение экзоферментов и экзотоксинов — факторов па-тогенности. Гиалуронидаза гидролизует гиалуроновую кис­лоту, которая перестает образовывать сгусток при добавлении уксусной кислоты. Для определения этого фермента в пробир­ку с субстратом (гиалуроновой кислотой) вносят суточную культуру бактерий или фильтрат бульонной культуры и инку­бируют в течение 15 мин при 37 °С. Затем добавляют 2—3 капли концентрированной уксусной кислоты. В пробах, где содержится гиалуронидаза, не происходит образования сгустка.

Плазмокоагулаза выявляется при посеве испытуемой культуры в 0,4 мл стерильной цитратной плазмы крови. Посе­вы ингибируют при 37 °С в течение 2—5 ч. В случае выработки фермента происходит свертывание плазмы, а в контроле она остается жидкой.

Гемолизин определяют путем посева испытуемой куль­туры "бляшками" в чашки Петри с кровяным агаром. Чашки инкубируют в термостате при 37 °С в течение суток. В поло­жительном случае вокруг "бляшек" образуются прозрачные зоны гемолиза.

Определение титра гемолитической активности бактериального экзотоксина (0-стрептолизина). Из фильтрата бульонной культуры р-гемолитического стрептокок­ка готовят ряд двукратных серийных разведений. К каждому из них добавляют равный объем 5 % взвеси отмытых эритро­цитов кролика. Смесь инкубируют в термостате при темпера­туре 37 °С в течение 1 ч. Параллельно инкубируют контроль­ную взвесь эритроцитов в питательном бульоне того же соста­ва. Учет результатов производят по наличию гемолиза (крас­ная, прозрачная "лаковая" кровь) или отсутствию гемолиза (осадок эритроцитов). Определяют наибольшее разведение (титр) фильтрата бульонной культуры стрептококка, при кото­ром еще наблюдается гемолиз. В дальнейшем этим разведением пользуются при определении рабочей дозы О-стрептолизина для постановки антистрептолизиновой реакции.

Лецитиназа выявляется при посеве на агар с лецитином. Вокруг колоний бактерий, выделяющих фермент, образуется зона помутнения с перламутровым блеском.

Лецитиназная проба: для быстрого обнаружения и се­рологической идентификации а-токсина клостридий — возбу­дителей газовой гангрены — в раневом отделяемом определяют его лецитиназную активность в реакции нейтрализации с анти­сыворотками против токсинов клостридий разных видов (см. табл. 12.2.2). С этой целью исследуемый материал (раневое отделяемое) помещают в пробирки с раствором лецитина и добавляют антисыворотки. Присутствие лецитиназы в раневом отделяемом проявляется помутнением жидкости в пробирке. При нейтрализации лецитиназной активности токсина соот­ветствующей антисывороткой жидкость остается прозрачной. Цитотоксины. Для обнаружения некоторых бактериаль­ных токсинов, оказывающих цитопатическое действие на клет­ки (ЦПД), используют клеточные культуры. Бактерии выращи­вают в бульоне. Затем питательную среду отделяют от микро­бов и вносят в культуру чувствительных клеток. В положитель­ном случае после инкубации наблюдается характерное ЦПД. Бактериальные токсины различаются по характеру ЦПД, ко­торое может проявляться изменением формы, размеров клетки, появлением вакуолей в цитоплазме, нарушением целостности клеточного монослоя и т.д.

Методы определения вирулентности бактерий и активности бактериальных токсинов на экспериментальных животных

Экспериментальное заражение животных. Инфек­ционный процесс может быть искусственно воспроизведен пу­тем заражения лабораторных животных: кроликов, морских свинок, белых мышей, белых крыс и др. Это производится для изучения патогенности и вирулентности микроорганизмов, вы­деления чистой культуры возбудителя из различных материалов (метод биопробы), воспроизведения экспериментальной ин­фекции и других целей.

Заражают животных накожно, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, внутривенно, внутрибрюшинно, перорально, интраназально, интратрахеально и интрацеребрально. Все ма­нипуляции осуществляют с помощью стерильных инструмен­тов. Перед началом опыта животных отбирают, взвешивают и маркируют. Мышь берут за хвост, опускают на стол, туловище быстро прижимают к столу двумя пальцами и, скользя ими по спине, захватывают кожу над головой и фиксируют животное в левой руке в растянутом положении. Взвесь микроорганиз­мов определенной концентрации набирают в шприц через иг­лу. Шприц держат как писчее перо в правой руке. При под­кожном заражении иглой прокалывают кожную складку на спине или у корня хвоста и медленно вводят содержимое шприца под кожу. Затем иглу быстро извлекают, прикрыв место инъекции ватой, смоченной спиртом. При внутрибрю-шинном заражении животное фиксируют головой вниз, чтобы кишечник переместился к диафрагме. В левой нижней трети живота делают прокол кожи, удерживая иглу под острым уг-

пипетки выдувают в пробирку со средой. Из ткани легких готовят мазки-отпечатки и делают посевы.

Брюшную полость вскрывают продольным разрезом брю­шины ножницами, не задевая кишечник. Осматривают органы брюшной полости, отмечая в протоколе наличие экссудата, величину, цвет и консистенцию печени, селезенки, надпочеч­ников, брыжеечных лимфатических узлов. При необходимости делают посевы из этих органов на питательные среды.

Для приготовления мазков-отпечатков вырезают из печени, селезенки, почек небольшие кусочки ткани, берут их пинцетом и прикасаются к предметному стеклу поверхностью разреза. Мазки-отпечатки фиксируют в жидком фиксаторе и окраши­вают метиленовым синим. При микроскопии отмечают при­сутствие микроба-возбудителя в различных органах и тканях. Результаты посевов учитывают на следующий день после ин­кубации в термостате. Данные вскрытия трупа протоколируют. Труп животного после вскрытия подлежит уничтожению.