2. Количественный анализ

В области количественного анализа ТСХ может дать ответ только на вопрос: “Не превышает ли содержание примеси определенный уровень”. При применении денситометров этот вопрос можно сконкретизировать до “Сколько содержится данного вещества в смеси?”, но только в том случае, если имеется калибровка по определяемому веществу. Однако, относительная погрешность измерения в этом случае достаточно велика. Достоверность анализа по системе “не больше” в силу этого превышает достоверность по системе “сколько”. Кроме того, применение качественных денситометров значительно удорожает процесс. Для определение количественного состава смеси использование жидкостного хроматографа предпочтительнее.

При ответе на первый вопрос (“не превышает ли…?”) на хроматограмму наносят строго определенное количество анализируемого вещества, рядом – одно или несколько пятен обнаруживаемой примеси с разным ее содержанием (свидетели). После элюирования пластинки пятна проявляют подходящим образом и сравнивают интенсиность окраски и площадь пятна с этими же параметрами свидетелей. Если для анализируемого вещества имеется НТД, строго регламентирующая содержание примеси на определенном уровне, то используют только один свидетель с заданным содержанием примеси. В этом случае положительный (соответствует) или отрицательный (не соответствует) результат анализа определяется по тому, превышает или не превышает по совокупности площади и интенсивности окраски пятно примеси пятно свидетеля. При этом наиболее надежный (достоверный) результат получается в том случае, если количество анализируемого образца подобрано таким образом, чтобы в нем примесь содержалась на границе обнаружения, а в свидетеле – пятно было четко различимым и надежно определяемым. Так, например, в амиксине регламентируется содержание 2-[2–(диэтиламино)этокси]флуоренона-9 – “не более 0.1 %”. Чувствительность обнаружения этой примеси составляет 0.05 мкг. Тогда, при нанесении 200 мкг амиксина и 0.2 мкг 2-[2–(диэтиламино)этокси]флуоренона-9 (0.1 % основного вещества и в 4 раза боьше предела обнаружения) и наличии на хроматограмме слабо различимого пятна примеси при четком пятне свидетеля, можно с высокой степенью достоверности утверждать, что содержание этой примеси в амиксине меньше заданного предела.

6. Ошибки и проблемы в тонкослойной хроматографии

Наиболее распространенными ошибками с которыми может сталкиваться исследователь при проведении хроматографического анализа являются следующие:

“ложно-отрицательные” – на основании совпадений R_fанализируемого вещества и вещества сравнения делается ошибочный вывод об их идентичности, или вывод об отсутствии примеси в анализируемом образце делается на основании наблюдения единственного;

“ложно-положительные” – наличие двух пятен на хроматограмме пробы принимается за наличие примеси в анализируемом веществе;

“реакция прошла” – на основании наличия на хроматограмме реакционной смеси пятна, характерного для продукта реакции, при отсутствии пятна, характерного для исходного(ых) вещества, делается вывод об ее прохождении.

1. “Ложно-отрицательные” ошибки в тсх

Ошибки первого типа могут возникать из-за совпадения значений Rf двух разных веществ в выбранных условиях хроматографического анализа. В большинстве случаев эта ошибка преодолевается использованием для анализа нескольких разных сочетаний сорбент-элюент. Наиболее типичной причиной возникновения ошибок в этом случае является использование в элюенте растворителей сильно различающимися значениями элюотропных параметров (бензол – метанол, гексан – ацетон, бензол – хлороформ – метанол – вода). В этом случае оба вещества практически не элюируются более “легким” компонентом элюента (с меньшим значением элюотропного параметра). По мере элюирования к точке нанесения подходит -фронт, в котором скачкообразно нарастает концентрация более “тяжелого” компонента. Если в этом элюенте для обоих веществ Rf близко к 1, то возникает впечатление идентичности анализируемых образцов. Характерной особенностью, по которой можно заподозрить наличие такого рода ошибки является то, что эти пятна “висят” непосредственно под-фронтом, или “лежат” непосредственно на нем.

Однако, если вещество и примесь могут образовывать устойчивый межмолекулярный комплекс (этот комплекс должен быть по крайней мере более выгоден чем адсорбция каждого из компонентов на сорбенте), который хроматографируется как отдельное вещество. Разрешение ошибки в этом случае может быть достигнуто применением реагентов, избирательно реагирующих с одним из участников этого комплекса. Простейшим способом является введение в точку нанесения сильной кислоты или основания, или добавление приемлемых кислот или оснований в состав элюента.

Так было обнаружено, что смесь азлактона и исходного для его получения альдегида хроматографируется как одно вещество, давая единственное пятно на хроматограмме. Введение в анализируемую пробу этой смеси ацетата фенилгидразина приводит к появлению на хроматограмме двух дополнительных пятен, а не одного, как можно было ожидать. При этом Rf азлактона увеличивается с 0.5 до 0.65. Аналогично, смесь бензанилида, бензойной кислоты и анилина, образующейся при синтезе бензанилида по Эйнгорну хроматографируется как единственное вещество, причем, анилин по реакции с нингидрином на пластинке в пятне не обнаруживается. После обработки этой смеси раствором карбоната натрия остаток, не растворенный в воде, дает уже два пятна – анилида и анилина, а на хроматограмме водной вытяжки после обработке ее кислотой обнаруживается единственное пятно, соответствующее бензойной кислоте.