3 Антитела. Определение. Структура молекулы иммуноглобулина.
Антитела – это иммуноглобулины сыворотки крови, специфично взаимодействующие с определенным антигеном.
Антитела составляют основу гуморального иммунитета.
Свойства антител: аффинность, авидность.
Аффинность – это сила (активность) связывания (сродство) активного центра антитела с эпитопом антигена (антигенной детерминантой. Степень аффинности определяется степенью (уровнем) совпадения конфигураций, комплементарностью активного центра антитела с эпитопом антигена, подобно ключу в замочной скважине.
Авидность – это прочность (жадность) связывания всей иммуноглобулиновой молекулы с антигеном. Авидность зависит как от аффинности, так и от валентности (количества активных центров) антител. При равной аффинности у Ig M авидность больше, чем у Ig G.
Моноклональные антитела – это высокоспецифические антитела с большой степенью авидности к определенной детерминантой группе антигена, продуцируемые одним клоном В-клеток. Обычно при иммунизации антигеном в сыворотке крови появляется широкий спектр Ат с различной аффинностью, то есть различной конфигурацией активного центра антител (паратопа). Это обусловлено тем, что антиген стимулирует большое количество клонов В-лимфоцитов. Получаемые таким образом поликлональные иммунные антитела и сыворотки представляют смесь иммуноглобулиновых молекул различных классов. Впервые методику получения моноклональных антител гибридомную технологию предложили Д.Келлер и Ц. Мильштейн в 1975 г. Технология получения гибридом состоит из нескольких этапов. Вначале проводят иммунизацию мышей антигеном. Из селезенки животных получают В-лимфоциты, продуцирующие специфичные антитела. Затем проводят слияние этих В-лимфоцитов с В-клетками мышиной опухоли - плазмоцитомы с помощью полиэтиленгликоля, разрушающего клеточные мембраны. Клетки плазмоцитомы не способны к синтезу Ат, но делятся непрерывно, являются «бессмертными», т.к. опухолевые. Слияние геномов этих клеток под одной клеточной мембраной приводит к появлению гибридных клеток. Получившаяся гибридома приобретает способность к синтезу специфических антител (от иммунных В-лимфоцитов) и становится долгоживущей, непрерывно делящейся (как плазмоцитома). Гибридомы отделяют от исходных клеток культивироанием на элективной ГАТ-среде (содержит гипоксантин, аминоптерин, тимидин). Выращенную смесь гибридных клеток разводят до 1 клетки в 1 объеме жидкой питательной среды в лунке микропанели и размножают (клонируют). Имея одинаковые структуру, идиотип и специфичность, моноклональные антитела нашли широкое применение в идентификации различных видов микробов, гормонов, медиаторов, маркеров лимфоцитов (CD), при определении совместимости тканей, групп крови.
Структура молекулы иммуноглобулина.
Структура молекулы иммуноглобулина была расшифрована Р. Портером и Д. Эдельманом с помощью протеолитических ферментов. Исследования Д. Эдельмана, выполненные с использованием меркаптоэтанола, который разрушает межцепьевые дисульфидные связи (-S-S-), показали наличие в молекуле иммуноглобулина двух тяжелых Н-цепей (heavy, по 50 кД) и двух легких L-цепей (light, по 25 кД). Р. Портер (1959) показал, что обработка кроличьих Ig G ферментами папаином (выше дисульфидных связей), а пепсином (ниже дисульфидных связей –тогда Fc-фрагмент разрушается) расщепляет молекулу на три фрагмента. Два из них Fab-фрагмент (fragment antigen binding) не кристаллизующиеся, способны связывать антигены и один Fc-фрагмент (fragment crystallizable) легко кристаллизующийся, но не связывающий антиген.
Как в Н-, так и в L-цепях имеется вариабельная (V) область, в которой последовательность аминокислот непостоянна, и константная (С) область с постоянным набором аминокислот. Вариабельные области Н- и L-цепей формируют Fab-фрагменты антитела.
L-цепи у иммуноглобулинов всех классов являются общими и бывают двух типов: (лямбда) и (каппа). Н-цепи иммуноглобулинов различаются по антигенности и соответственно классам Ig G, Ig М, Ig А, Ig Е и Ig D различают полипептидные -, -, -, -, -цепи (420-700 аминокислотных остатков).
4
Свойства антител всех классов.
В зависимости от структуры тяжелых цепей выделяют 5 классов (изотипов) антител: Ig G, Ig М, Ig А, Ig Е и Ig D.
Ig класса G – составляют основную массу иммуноглобулинов сыворотки крови (75-85%), концентрация в крови – 8-12 г/л. Двухвалентный. IgG неоднородны по строению Fc-фрагмента и различают их четыре субкласса G1, G2, G3, G4, процентное соотношение которых 65:20:10:5. IgG является единственным иммуноглобулином, проникающим через плаценту в организм плода, формируя пассивный иммунитет у новорожденных и детей раннего возраста. При первичном иммунном ответе максимальные титры IgG наблюдаются на 6-8 сутки. G составляют основную массу антител при вторичном иммунном ответе. При образовании комплекса IgG с антигеном комплемент активируется по классическому пути. IgG участвуют в реакциях лизиса, нейтрализации, опсонизации (усиливают фагоцитоз за счет специфического связывания с рецептором к Fc-фрагменту на мембране фагоцитов).
Ig класса М – пентамер из 5 субъединиц, соединенных дисульфидными связями, имеет 10 Аг-связывающих участков. Концентрация Ig М в крови – 1 г/л. Ig М образуются первыми при первичном иммунном ответе, т.е. обнаружение Ig М к конкретному возбудителю указывает на наличие острого инфекционного процесса. Мономеры Ig М являются рецепторами В-лимфоцитов. Ig М агглютинируют, преципитируют, опсонизируют, антигены, активируют комплемент по классическому пути.
Ig класса А – подразделяются на сывороточный и секреторный (sIgA). Концентрация IgА в крови – 2 г/л. В крови IgА присутствует в виде мономеров, а в секретах (слюне, слезной жидкости, кишечной слизи и т.д.) в форме димеров или тримеров. Димеры характеризуются наличием дополнительной J-цепи, сшивающей два мономера в области Fc-фрагмента, и секреторного компонента, который присоединяется к IgА при прохождении через эпителиальные клетки. Секреторный компонент обеспечивает защиту IgА от расщепления протеолитическими ферментами секретов. Секреторные IgА осуществляют местный иммунитет, препятствуют адгезии микроорганизмов (бактерий и вирусов) к эпителию слизистых оболочек. Новорожденные получают секреторный иммуноглобулин А с молоком матери.
Ig класса Е - Концентрация в крови – в норме 0,25 мг/л, при аллергических заболеваниях до 1,6 мг/л. Иммунный комплекс антигена и IgЕ специфически взаимодействует с рецепторами к Fc-фрагменту IgЕ тучных клеток и базофилов, вызывая их дегрануляцию – выброс гистамина, серотонина и т.д., т.е. развитие гиперчувствительности немедленного типа. Считают, что IgЕ играет защитную роль при гельминтозах и протозойных заболеваниях, в частности способствует усилению фагоцитарной активности макрофагов и эозинофилов.
Ig класса D – биологическая роль этого Ig не установлена. Ig D служат рецепторами созревающих В-лимфоцитов. Увеличение титра IgD отмечается при беременности, системной красной волчанке, бронхиальной астме и у лиц с иммунодефицитами.
МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ АНТИТЕЛ:
Нейтрализация активных центров токсинов,
Образование комплекса антиген-антитело, который активирует комплемент с последующим лизисом клетки,
Опсонизация объекта фагоцитоза,
Связывание с Fc-рецепторами лейкоцитов, которые приобретают способность специфично взаимодействовать с антигенами.