11-10-2014_10-21-29 / Беспалов А.Ю., Звартау Э.Э. - Нейропсихофармакология антагонистов NMDA-рецепторов

		Список сокращений
АМРА	—	а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксгзол-пропионовая кислота
АЦ	—	аденилатциклаза
БАС	—	боковой амиотрофический склероз
Б Я Ш	—	большое ядро шва
ВТО	—	вентральная тегментальная область
ГАМК	—	у-аминомасляная кислота
ГМ>)	—	лимбический гностический модуль
ГМСм	—	сенсомоюрный гностический модуль

ДД— долговременная депрессия

ДП	—	долговременная потенциация
ПКА	—	протеинкиназа А
ПКС	—	протеинкиназа С
П Ф К	—	префронтальная кора
ПЯ	—	прилежащее ядро перегородки
NMDA	—	N-метил-о-аспарагиновая кислота
ТАН	—	тонически активные нейроны
цАМФ	—	циклический аденозинмонофосфат
ФЛ	—	фосфолипаза
ФП	—	фосфопротеины
ЧС	—	черная субстанция
ЦОВ	—	центральное околоводопроводное вещество
ЭЭГ	—	электроэнцефалография

NMDA-рецепторыыи комплекс 1 как потенциальная мишень

действия лекарственных средств

Глутаминовая кислота была открыта Риттхаузеном (Ritthausen) в 1866 г, и. уже к началу 1900-х гг установлено, что глутамат — важный компонент нервной ткани (Kmjevic, 1974) Интенсивное исследование роли глутамата в деятельности ЦНС начато в конце 1950-х гг , когда была выявлена его способность возбуждать нейроны и был доказан специфический (рецепторный) механизм этого эффекта (Watkins, Evans, 1981) В последующих исследованиях установлено, что глутамат и ряд других возбуждающих аминокислот (например аспартат) — основные возбуждающие медиаторы ЦНС млекопитающих, и открыто множество подтипов глутаматных рецепторов

1.1. Классификация глутаматных рецепторов

Глутаматные рецепторы подразделяют на две основные подгруппы — ионотропные (табл 1 1) и метаботропные (табл 12) Основное отличие между этими подгруппами состоит в том, каким образом связывание глутамата с рецептором отражается на изменении внутриклеточного гомеостаза — путем изменения мембранной проницае-

Таблица 1.1. Подтипы ионотропных глутаматных рецепторов

* АМРА-рецепторы, у которых отсутствует С1иН2-субъединица, подвергшаяся РНК-редактирова- нию а) формируют канал с высокой электропроводимостью, проницаемый для Са2+, б) чувствительны квнутриклеточным полиаминам (блокада придеполяризации мембраны) Аналогичнымихарактеристикамиобладаюткаинатныерецепторыснередактированнымисубъединицами GluR5 и GluR6

12	Глава 1. NMDA-рецепторныйкомплекс

Таблица 1.2. Группы метаботропных глутаматных рецепторов

мости для катионов (ионотропные рецепторы) или через системы вторичных посредников, сопряженные с G-белками (метаботропные). В настоящей работе будут рассмотрены только ионотропные глутаматные рецепторы.

Выделяют три основных подтипа ионотропных глутаматных рецепторов (табл. 1.1), получивших свои названия по именам селективных агонистов этих рецепторов (рис. 1.1): N-метил-о-аспарагиновой кислоты (NMDA), а-амино-3-гидро- кси-5-метил-4-изоксазол-пропионовой кислоты (АМРА), каиновой кислоты.

Следует также заметить, что до сих пор появляются работы, авторы которых разделяют глутаматные рецепторы на NMDA- и He-NMDA-подтипы. Возможно, такое разделение отражает тот факт, что наиболее изученным подтипом глутаматных рецепторов по-прежнему остается NMDA-подтип. Именно NMDA-рецепторы, а точнее, селективные антагонисты этих рецепторов, наиболее интересны для разработки и внедрения в клиническую практику. Во-первых, молекулярная структура, нейроанатомическое распределение и физиологические функции NMDA-рецепторов достаточно хорошо изучены, что позволяет уверенно предсказывать фармакологический профиль того или иного лиганда. Во-вторых, синтезировано огромное количество веществ, избирательно связывающихся с этими рецепторами. Методами биохимического, электрофизиологического и поведенческого анализа было выделено несколько десятков веществ, которые не только избирательно связываются cNMDA-рецепторами, но и обладают выраженным терапевтическим потенциалом. В данной и последующих главах основное внимание будет уделено именно NMDAрецеиторам и их антагонистам.

1.2. Строение NMDA-рецепторного комплекса

NMDA-рецепторный комплекс имеет сложное надмолекулярное строение и составлен из нескольких белковых субъединиц (рис. 1.2). NMDA-рецепторы с различным составом характеризуются неоднородным распределением в ЦНС, что приводит к многообразию их физиологическихфункций и создает перспективы для дифференцированного фармакогешюго контроля активности определенных подтипов NMDA-рецепторов и соответствующих нормальных и патофизиологических процессов.

1.2. Строение NMDA-рецепторного комплекса

13

L-Глутаминовая кислота

L-Аспарагиновая кислота

N-метил-О-аспарагиновая кислота

Хинолиновая кислота

D-Серин

Каиноваякислота

АМРА

Рис. 1.1. Химическая структура некоторых агонистов ионотропных глутаматных рецепторов

В целях обзора возможных путей фармакогенной коррекции активности NMDAрецепторного комплекса следует выделить несколько связывающих участков, каждый из которых влияет на работу трансмембранного канала, сопряженного с NMDAрецептором.

1.2.1. Субъединицы NMDA-рецепторов

Точная композиция NMDA-рецепторного комплекса еще не установлена окончательно, однако к настоящему времени клонировано 3 типа субъедипиц, формирующих NMDA-реценторный комплекс - NR1 (NMDA-£), NR2 (NMDA-e) и NR3 (NMDA-x) (McBam, Mayer, 1994; Danysz, Parsons, 1998; Dunah et al, 1999).

О сложном комплексном характере строения NMDA-рецепторов свидетельствует также обнаружение 8 функционально значимых изоформ и 1 функционально неактивной изоформы NR1-субъединицы, экспрессия которых определяется альтернативным сплайсингом одного гена. Кроме того, установлено, что NR2-cy6beflHHHna существует в 4 разновидностях — NR2A, NR2B, NR2C и NR2D, каждой из которых соответствует один ген (McBain, Mayer, 1994; Dunah et al., 1999). Из NR2-cy6beflHHHn только для

14 Глава 1. NMDA-рецепторный комплекс

NR2D известна более чем одна изоформа. Два подтипа NRS-субъединицы лишь недавно были выявлены и поэтому еще недостаточно изучены (Das et al., 1998).

Известно, что присутствие как NR1-, так и ЫК2-субъединиц в ЦНС млекопитающих необходимо для формирования функционально активных рецепторов. Полученные в последнее время данные указывают на то, что каждый рецепторный комплекс имеет в своем составе 2 субъединицы NR2 и 2-3 субъединицы NR1 (Monyer et al., 1994; Behe et al., 1995; Premkumar, Auerbach, 1997; Dunah et al., 1998; Laube et al., 1998; Dunah et al., 1999). С помощью методов гибридизации in situ и иммуногистохимии установлено, что субъединица NR1 встречается практически во всех структурах ЦНС (Monyer et al., 1994; Petralia et al., 1994). Распределение субъединиц NR2A-D более динамичное, и паттерн экспрессии NR2-субъединиц претерпевает значительные изменения в процессе онтогенеза (Akazawa et al., 1994; Monyer et al., 1994). Неоднородность анатомического распределения различных подтипов NR2-субъединиц во многом объясняет многообразие функций NMDA-рецепторов в различных отделах ЦНС, что подтверждено данными радиолигандного связывания (Monaghan et al., 1988), а также результатами функциональных (Howe et al., 1991; Hestrin, 1992) и фармакологических (Kashiwagi et al., 1997; Cull-Candy et al., 1998; Stocca, Vicini, 1998) исследований.

Таким образом, возможно, что именно субъединица NR2 определяет фармакологическую специфичность NMDA-рецепторного комплекса (Yamakura, Shimoji, 1999; табл. 1.3). Поэтому неудивительно, что значительное внимание исследователи уделяют тому, какие типы субъединиц NR2 и в каком соотношении и количестве входят в функционально полноценный NMDA-рецепторный комплекс (Monyer et al., 1994; Behe et al., 1995; Premkumar, Auerbach, 1997; Laube et al., 1998). В состав нативных

Таблица 1.3. Типы субъединиц NR2
Основные		Типысубъединиц
характеристики	NR2A	NR2B	NR2C	NR2D
Аффинность глутамата1	+	++	++	+++
Аффинность глицина1	+	++	+++	++++
Аффинность полиаминов1	+	+4	-	-
Чувствительность к магнию	+++3	+++	+	+
Анатомическое	Широкое	Передний	Ограниченное Ствол мозга,
распределение2	(максимум —	мозг	(мозжечок)	спинной мозг
	в гиппокампе)
Онтогенез	Постнатально	Эмбрион	Постнатально	Эмбрион
(максимум экспрессии)

1Сравнительная характеристика для гетеромеров NR1+NR2.

2Данная характеристика отражает лишь общие тенденции нейроанатомического распределения, так как во многих структурах мозга присутствуют все субъединицы (например в мозжечке; CullCandy etal., 1998).

3Эта субъединица определяет также чувствительность к Zn2+.

4 Потенцирующее действие гистамина связано с действием на эту субъединицу.

1.2. Строение NMDA-рецепторного комплекса

15

NMDA-рецепторов могут входить либо две одинаковые, либо две различные субъединицы NR2, что еще больше увеличивает многообразие форм NMDA-рецепторов

исоздает дополнительные мишени для фармакологического воздействия.

1.2.2.Основные связывающие (распознающие) участки NMDA-рецепторного комплекса

ВNMDА-рецепторном комплексе различают несколько связывающих участков:

1)участок связывания агонистов (глутамат, NMDA) и конкурентных антагонистов;

2)участок связывания коагонистов глицина и D-серина (другие названия этого ре-

цептора: стрихнин-нечувствительный глициновый рецептор, глицинв-рецептор) и глициновых антагонистов (Johnson, Ascher, 1987; Danysz, Parsons, 1998);

3)участок связывания полиаминов (спермин, спермидин) и полиаминовых антагонистов (Williams, 1993; McBain, Mayer, 1994);

4)участок связывания "канальных" блокаторов (фенциклидин, кетамин, мемантин) (McBain, Mayer, 1994; Dingledine et al., 1999);

5)участок связывания Mg2+ (Nowak et al., 1984);

6)участок связывания Zn2+ (Paoletti et al., 1997);

7)участок связывания H+ (Traynelis et al., 1995).

Кроме того, существуют специфические места связывания для других биоактивных веществ, таких как нейростероиды (например прегненолон; Wu et al., 1991; ParkChung et al., 1997; Weaver et al., 1997), нейропептиды (например, динорфин; Chen, Huang, 1993; Chen et al., 1995; Shukla, Lemaire, 1994), гистамин (Yamakura, Shimoji, 1999). Эффекты гистамина не наблюдаются в нормальных физиологических условиях, не блокируются классическими гистаминоблокаторами и, возможно, опосредуются полиаминовым участком (Saybasili et al., 1995).

На рис. 1.2 схематически показано соотношение специфических мест связывания и определенных субъединиц. Следует особо отметить, что NMDA-рецепторы акти-

Рис. 1.2. Схема строения NMDA-рецептора (Parsons et al., 1998). Воспроизведено с изменениями с разрешения издательства Prous Science. Агонисты — глутамат, NMDA. Коагонисты — глицин, D-серин. Модуляторы — полиамины, гистамин

16

Глава 1. NMDA-рецепторный комплекс

вируются только после того, как глутамат свяжется с обеими субъединицами NR2 (Mayer et al., 1989; Hirai et al, 1996; Laube et al., 1997), а глицин — с двумя NRl-субъе- диницами (Thedinga et al., 1989; Siegel et al., 1996; Williams et al., 1996). Эффекты глицина и других аллостерических модуляторов зависят не только от типа субъединицы, несущей место связывания, но и от композиции рецептора в целом. Например, участок связывания глицина находится на субъединице NR1. Константа ингибирования связывания для глицина составляет приблизительно 1-5 мкМ для гомомерных NMDA-рецепторов (только субъединицы NR1; Grimwood et al., 1995) и находится в наномолярном диапазоне для гетеромерных рецепторов (субъединицы NR1 и NR2; Grimwood et al., 1992).

Различные участки NMDA-рецепторного комплекса оказывают друг на друга модулирующие влияния (табл. 1.4). Например, связывание агонистов с глутаматным участком повышает сродство глицина к соответствующему участку, и наоборот. В то же время, обратные отношения отмечены для антагонистов этих участков (Thomson, 1990). Подобная информация может оказаться исключительно полезной в ситуации, когда два (или более) лиганда NMDA-рецепторов применяются одновременно с одной и той же или с различными целями. Данные радиолигандного связывания позволяют предсказать синергизм эффектов глициновых и полиаминовых антагонистов (Voltz et al., 1994).

Полиаминовый участок также оказывает влияние на связывание глутамата. Полиамины в низких концентрациях увеличивают связывание глутамата и глицина, а в высоких — ослабляют (Johnson, 1996; Williams, 1997). Таким образом, полиамины могут рассматриваться в качестве своеобразных веществ-регуляторов активации NMDA-рецепторов. В условиях длительной тонической активации NMDA-рецепто- ров (например высвобождение глутамата при нейродегенеративных расстройствах) полиамины ограничивают эффекты глутамата (снижают аффинность глутамата

Таблица 1.4. Аллостерические модулирующие взаимовлияния различных участков NMDA-рецепторного комплекса

Аг — связывание агонистов; Ант — связывание антагонистов; f — усиливающее влияние; I — угнетающее влияние; 0 — нет эффекта.

1.3. Основные физиологические функции NMDA-рецепторного комплекса

17

и способствуют потенциал-зависимой блокаде). В то же время эффекты высоких (деполяризующих) концентраций глутамата при фазной активации глутаматергической передачи усиливаются.

1.2.3.Трансмембранный ионный канал, ассоциированный

сNMDA-рецепторным комплексом

Канал, ассоциированныйсNMDА-рецептором, проницаемдля К+, Na+ и Са2+. Наосновании данных об электропроводности одиночных каналов предполагают, что cyajeствугот две популяции NMDA-рецепторов (Farrant et al., 1994; Momiyama et al, 1996; Brimecombe et al., 1997; Dingledine et al., 1999). Одна популяция формируется при участии субъединиц NR2А или NR2B и представляет собой давно известные NMDА-рецеп- торы с высокой проводимостью. Эти рецепторы чувствительны к блокаде Mg2+. Вторая популяция представляет собой NMDA-рецепторы с низкой проводимостью, низкой чувствительностью к Mg2+, имеющие в своем составе субъединицы NR2C или NR2D.

Открытие канала происходит при одновременном связывании агонистов с глутаматным и глициновым участками. Обязательным условием для открытия канала является связывание глицина, именно это послужило основой для признания глицина коагонистом, а не просто аллостерическим модулятором NMDA-рецепторов (Thomson, 1990; Danysz, Parsons, 1998).

Внутри канала находится участок (или участки) связывания "канальных" блокаторов (фенциклидин, кетамин, мемантин). Связывание (как, впрочем, и диссоциация) "канальных" блокаторов с их рецепторным участком возможно только при открытом канале. Иными словами, неконкурентная блокада NMDA-рецепторов этими веществами происходит лишь после связывания глутамата и глицина. Данный принцип был назван "use-dependency" и на многие годы определил интерес к разработке лекарственных средств на основе блокаторов канала, ассоциированного с NMDA-pe- цептором (см. гл. 1.8.2).

NMDA-рецепторному каналу присущи основные свойства, традиционно приписываемые ионным каналам, управляемым лигандами (хемочувствительные каналы): а) катионная проницаемость; б) потенциал инактивации, близкий к 0 мВ. Однако в отличие от многих других каналов вероятность открытия канала, ассоциированного с NMDA-рецептором, снижается при гиперполяризации мембраны (Nowak et al., 1984; Ascher, Johnson, 1990). Такая зависимость от мембранного потенциала связана

сблокадой NMDA-рецепторов Mg2f (см. далее).

1.3.Основные физиологические функции NMDA-рецепторного комплекса

Как уже отмечалось, глутамат — основной возбуждающий медиатор в ЦНС млекопитающих. Не вызывает удивления тот факт, что огромное количество физиологических функций основано на активном использовании глутаматергической передачи. Было бы нецелесообразно попытаться описать все возможные физиологические эффекты активации NMDA-рецепторного комплекса. Тем не менее, можно выделить три основные физиологические функции NMDA-рецепторов, которые отражают функциональные особенности этих рецепторов и служат основой для разработки методов фармакологической модуляции.

18	Глава 1. NMDA-рецепторный комплекс

1.3.1. Регуляция нейрональной возбудимости и клеточная смерть

Термин "возбуждающие аминокислоты" традиционно используется по отношению к кислым аминокислотам, являющимся агонистами глутаматных рецепторов (например глутаминовая и аспарагиновая кислоты), и уже само название отражает одну из основных функций NMDA-рецепторного комплекса. Открытие канала, ассоциированного с NMDA-рецепторным комплексом, приводит к увеличению концентрации внутриклеточного кальция, поступающего по градиенту концентрации. Именно с кальцием связывают повышение нейрональной активности, опосредованное NMDA-рецепторами.

Перевозбуждение нейрона при интенсивном воздействии глутамата сопровождается переходом нормально функционирующих нейронов в состояние эпилептиформной активности, что может проявляться развитием судорог. Судороги возникают при аппликации возбуждающих аминокислот на кору головного мозга, при локальном их введении в желудочки мозга, а также при системном введении (Meldrum, 1995; Chapman, 1998). Эпилептиформная активность развивается не только при химической стимуляции мозга экзогенными агонистами, но и при электрической стимуляции глутаматергических проекций (Stasheff et al., 1989; DeLorenzo et al., 1998).

Длительная избыточная активация NMDA-рецепторов приводит к патологическому повышению внутриклеточной концентрации кальция и запускает необратимые изменения (активация Са2+-зависимых протеаз, эндонуклеаз, фосфолипаз), ведущие к гибели нейрона (так называемый механизм "кальциевой смерти"). Гибель нейронов наблюдается при системном и локальном введении больших доз агонистов, а также в культурах нейронов, обогащенных высокими концентрациями агонистов (Meldrum, Garthwaite, 1990; Meldrum, 1998). Впервые нейродегенеративные изменения были описаны в нейронах сетчатки после системного введения L-глутаминовой кислоты, однако этот феномен обычно трудно воспроизвести ввиду наличия высокоэффективного механизма обратного захвата глутамата. Поэтому наиболее достоверные результаты получают, используя синтетические агонисты глутаматных рецепторов, а также природные аналоги, механизмы инактивации которых малоэффективны (Kohler, Schwarcz, 1983). Следует заметить, что необратимые дистрофические изменения наблюдаются также и при электрической стимуляции глутаматергических проекций (Scharfman, Schwartzkroin, 1989).

Нейротоксическое действие возбуждающих аминокислот стало предметом исключительно интенсивного изучения после того, как была установлена глутаматергическая природа многих нейродегенеративных расстройств, и возбуждающие аминокислоты стали рассматривать в качестве "эндогенных факторов нейротоксичности". К нейропатологическим состояниям, обусловленным гиперактивностью глутаматергической системы, относят не только классические нейродегенеративные расстройства (болезнь Альцгеймера, хорея Гентингтона, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз), но и ишемические поражения головного мозга, различные энцефалопатии (включая диабетические), когнитивные и мнестические расстройства на поздних стадиях эпилепсии, алгоколизма и др. (Meldrum, 1998; Tsai et al., 1995; Leigh, Meldrum, 1996; Chapman, 1998; Farber et al., 1998; Meldrum, 1998; Loopuijt, Schmidt, 1998).

Иными словами, речь идет практически о всех патологических состояниях, при которых наблюдается гибель нейронов. При этом избыточное высвобождение глута-

1,3. Основные физиологические функции NMDA-рецепторного комплекса

19

мата может быть как первичным (генетически детерминированные отклонения в уровнях экспрессии глутаматных рецепторов, транспортеров и т. д.), так и вторичным звеном патологического процесса (нарушение кислородного баланса нейрональной ткани, ослабление гетеросистемного контроля пресинаптического высвобождения глутамата и т. д.). Ив том и в другом случае глутамат играет ключевую роль в каскадной реакции гибели нейрона, что подтверждается большими повреждениями в тех структурах мозга, которые наиболее богаты глутаматными рецепторами. Например, даже при краткосрочной ишемии головного мозга наблюдается практически полная гибель пирамидных нейронов гиппокампа (Davis et al., 1986).

Следует отдельно отметить, что рН-чувствительность NMDA-рецепторного комплекса (из-за наличия специфического места связывания протонов) еще больше подчеркивает участие этих рецепторов в процессах, приводящих к гибели нейронов. Так, ионы Н+ подавляют возбудимость нейронов и активность NMDA-рецепторного комплекса (McBain, Mayer, 1994). Повышение синаптической активности (т. е. повышение пресинаптического высвобождения глутамата) приводит к закислению внеклеточной среды вследствие низкого рН в везикулах, участвующих в синаптическом выбросе глутамата (Krishtal et al., 1987). Поэтому ингибирование NMDA-рецептор- ного комплекса протонами может служить примером отрицательной обратной связи при избыточной секреции глутамата и, соответственно, чрезмерной стимуляции NMDA-рецепторов. В то же время имеются данные, что ингибиторы карбоангидразы увеличивают возбуждающее действие глутамата (Taira et al., 1993).

В последние годы появляется много работ, указывающих на роль глутаматергической системы в механизмах "запрограммированной клеточной смерти" (апоптоз). Например, недавно установлено, что |3-амилоид вызывает гибель нейронов по механизму апоптоза, запускаемому транспортом Са2+ через активированные каналы NMDA-рецептора (Le et al., 1995). Как ни парадоксально, эти данные подчеркивают единство физиологических функций системы "возбуждающих аминокислот", так как апоптоз по сути является специфической формой клеточной памяти (McConkey et al., 1996).

1.3.2.Синаптическая пластичность

Сионами кальция связана также другая основная функция NMDA-рецепторов — синаптическая пластичность. Термин "синаптическая пластичность" используется для описания механизмов памяти и обучения не только в традиционном понимании, но и для обсуждения основ различных форм привыкания, центральной сенситизации при хронической боли (явление "wind-up"), толерантности, лекарственной зависимости и др.

В основе этой функции лежат два уже описанных ранее свойства NMDA-рецепто- ров — потенциалзависимость и "use-dependency". При потенциале покоя, а также при гиперполяризации мембраны ионы Mg2+, будучи связанными с внутриканальным участком, не дают Са2+ проникнуть внутрь клетки. Деполяризация мембраны (от -50 до -30 мВ) снимает "магниевый блок" и таким образом открывает канал. Следует также заметить, что для деполяризации мембраны не требуется участия дополнительных нейромедиаторных систем, так как результат достигается при активации глутаматом ионотропных рецепторов He-NMDA-подтипов.