2.5. Приготовление мазков крови
Взятие крови производили в 10, 14, 18, 22, 2, 6 ч. Кровь использовали без антикоагулянта.
На сухое обезжиренное предметное стекло ближе к короткой стороне наносили небольшую каплю крови. Оставляли стекло в горизонтальном положении и размазывали каплю, крови по стеклу с помощью чистого шлифовального стекла, помещая его под углом 45о коротким ребром. Подождав, пока вся кровь расплывется по нему, быстро проводили по предметному стеклу. Мазки высушивали на воздухе и маркировали. Высушенные мазки помещали в кювету с фиксатором. Фиксировали мазки в течение 30 минут в этиловом спирте. Вынув из кюветы, оставляли на воздухе до полного высыхания. Фиксированные мазки окрашивали по Романовскому-Гимзе. В качестве красителя использовали готовый раствор Романовского-Гимзы, который перед употреблением разводили из расчета 1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды. Высохший фиксированный мазок помещали в кювету с рабочим раствором краски на 25-40 минут на «рельсы». Не снимая стекла с «рельсов» смывали водопроводной водой. Высушивали мазки на воздухе (Первушин Ю.В., Луговская С.А., Марченко Л.А., Бондарь Т.П., 2000).
2.6. Определение количества эритроцитов
Принцип метода – точное отмеривание крови и равномерное распределение ее в точно отмеренном количестве жидкости.
При взятии крови первую каплю, крови удаляют ваткой, а следующую каплю набирают в смеситель Потэна точно до метки 0,5 следя за тем, чтобы вместе с кровью не попали в смеситель пузырьки воздуха.
После взятия крови для ее разведения в этот же смеситель набирают 2% раствор NaCl до метки 101, то есть разводят в 200 раз. Содержимое тщательно перемешивают. Рассматривают под микроскопом сетку камеры Горяева, находят малые и большие квадраты. Сторона малого квадрата равна 1/20 мм, площадь 1/400 мм2, высота камеры – 1/10. Следовательно, объем малого квадрата равен 1/400 х 1/10 = 1/4000 мм3. На предметное стекло в том месте, где на нем расположены сетки Горяева, помещают покровное стекло и притирают его большими пальцами рук до появления ньютоновских колец – окрашенных в цвета радуги полосок. Одну треть содержимого смесителя выпускают на вату, а следующую каплю выдувают на предметное стекло под покровное.
Предметное стекло помещают на столик микроскопа, находят под малым увеличением сетку. Установив большое увеличение, производят подсчет.
Считают эритроциты в 80 малых квадратах (5 больших) учитывая лишь те из них, которые находятся внутри каждого малого квадрата, а так же на линиях, отграничивающих его верхнюю и правую стороны. При таком подсчете все эритроциты, которые входят в большой квадрат, будут сосчитаны.
Содержание эритроцитов (Х) в 1 мм кубическом вычисляют по формуле:
где, n – количество эритроцитов подсчитанных в 5 больших (или 80 маленьких) квадратах.
2.7. Определение количества содержания гемоглобина
Унифицированным методом определения гемоглобина является гемиглобинцианидный метод.
Принцип: Гемоглобин окисляют в метгемоглобин (гемиглобин) железосинеродистым калием (красная кровяная соль); гемиглобин при реакции с ацетонциангидрином превращается в гемиглобинцианид (цианметгемоглобин), окрашенное соединение, которое и определяют колориметрически. Концентрация гемиглобинцианида, равная 597,5 мг/л, соответствует 150 г гемоглобина в 1 л крови
Реактивы. Трансформирующий раствор ацетонциангидрин – 0,5 мг; калий железосинеродистый – 0.2 г: натрия гидрокарбонат – 1 г; дистиллированная вода – до 1 л. Готовый раствор желтого цвета, прозрачный. При обесцвечивании или появлении осадка реактив к работе непригоден. Реактив стабилен в течение нескольких месяцев, при хранении в посуде из темного стекла при комнатной температуре.
Оборудование. Фотоэлектроколориметр (КФК-2).
Ход определения. В пробирку к 5 мл трансформирующего раствора добавляют 20 мкл крови (разведение 1:251). Содержимое пробирки тщательно перемешивали. Колориметрию проводили не ранее, чем через 10 мин. при длине волны 520-560 нм (на КФК-2) в кювете с длиной оптического пути 10 мм против трансформирующего раствора.
Расчет содержания гемоглобина производили по калибровочному графику. Для калибровки использовали четыре раствора гемиглобинцианида с концентрациями, соответствующими содержанию гемоглобина в крови от 50 до 200 г/л. Использование подобных растворов позволяет построить график, который практически перекрывает весь диапазон нормы и патологии и, исключает ошибки, которые могут возникать при разведении одного раствора.
Содержимое ампул вносят в кюветы и измеряют оптическую плотность каждого раствора при длине волны 540 нм и длине оптического пути 10 мм. Затем, на миллиметровой бумаге по горизонтальной оси (абсцисс) откладывают концентрации гемоглобина в г/л, указанные в паспорте и соответствующие содержанию гемиглобин-цианида в ампулах. По вертикальной оси (ординат) откладывают величины экстинкции, полученные при измерении соответствующего раствора гемиглобинцианида. Калибровочный график должен представлять собой прямую линию, исходящую из начала координат.
Для определения фактора (коэффициента пересчета) следует аттестованную концентрацию каждого раствора разделить на величину оптической плотности (экстинкцию) данного раствора и вывести средний результат.
Определив коэффициент пересчета для данного прибора далее для определения концентрации гемоглобина, составляется таблица, в которой каждому значению экстинкции соответствует концентрация гемоглобина.