3. Очистка белков от низкомолекулярных примесей

Для удаления низкомолекулярных соединений, в частности сульфата аммония после высаливания, применяют диализ. Метод основан на том, что через полупроницаемую мембрану,пропускающую низкомолекулярные вещества, не проходят белки, имеющие более высокую молекулярную массу. В стакан большой ёмкости (около 1 л) с буферным раствором помещают полупроницаемый мешочек, заполненный раствором белка с солью.

Скорость выхода соли из мешочка в буферный раствор пропорциональна градиенту его концентраций по обе стороны от мембраны. По мере выхода соли из мешочка буферный раствор в стакане меняют.

Для очистки белков от низкомолекулярных примесей используют также метод гель-фильтрации .

Для определения частоты (гомогенности) выделенного белка применяют методы с высокой разрешающей способностью, например электрофорез в полиакриламидном геле, высокоэффективная хроматография высокого давления. От чистоты лекарственного белкового препарата зависят его биологическая эффективность и аллергенность (т.е. способность вызывать аллергические реакции). Чем качественнее очищен препарат, тем меньше вероятность осложнений при его применении.

анализ	абсорбция	механизм	Определяемая концентрация	Преимущества	Недостатки
УФ абсорбция	280 нм	Абсорбция тирозина и триптофана	0.1-100 мкг/мл	Небольшой объём образца, быстрота, низкая стоимость	несовместимость с детергентами и денатурирующими веществами высокая изменчивость
Бицинхониновая кислота	562 нм	Редукция меди (Cu2+ до Cu1+), БХК реакция с Cu1+	20-2000 мкг/мл	совместимость с детергентами и денатурирующими веществами, низкая изменчивость	Отсутсвие совместимости или низкая совместимость с восстановителями
Брэдфорд или Кумасси бриллиантовый синий	470 нм	Образование комплекса между Кумасси бриллиантовым синим красителем и белками	20-2000 мкг/мл	совместимы с восстанавливающими агентами, быстрота	несовместимость с детергентами
Лоури	750 нм	Редукция меди белками, редукция Фолина-Ciocalteu вследствие образования медно-белкового комплекса	10-1000 мкг/мл	высокой чувствительность и точность	несовместимость с детергентами и восстановителями, длительная процедура

10. Принципы классификации белков. Классификация по составу и биологическим функциям, примеры представителей отдельных классов.

Существует несколько классификаций белков. В основе их лежат разные принципы: по степени сложности (простые и сложные); по форме молекул (глобулярные и фибриллярные белки); по растворимости в отдельных растворителях (водора­створимые, растворимые в слабых солевых растворах — альбу­мины, спирторастворимые — проламины, растворимые в щелочах — глютелины), по выполняемым ими функциям, например запасные белки, скелетные и т. д.

Остановимся несколько подробнее на классификации по степени сложности. По этому принципу белки делят на протеины (про­стые белки), состоящие только из остатков аминокислот, и проте­иды (сложные белки), состоящие из белковой (апобелок) и небелковой частей (простетическая группа).

Протеины — запасные, скелетные, отдельные ферментные белки. По растворимости в отдельных растворителях выделим только главные:

• альбумины — белки с относительно небольшой молеку­лярной массой, хорошо растворимые в воде и в слабых солевых растворах

• глобулины — растворяются в водных растворах солей.

• проламины — растворяются в 60—80 %-ном растворе эти­лового, спирта.

• глютелины — растворяются только в растворах щелочей.

Протеиды — из этой группы сложных белков отметим только следующие:

• нуклеопротеиды — кроме белка включают нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты относятся к важнейшим биополимерам, которым принадлежит огромная роль в наследственности;

• липопротеиды — содержат кроме белка липиды. Содержатся в протоплазме и мембранах. Принимают участие в формировании клейковинных белков;

• фосфопротеиды — кроме белка присутствует фосфорная кислота. Им принадлежит важная роль в питании молодого организма. Пример: казеин — белок молока.