ХНС

Для визначення нітриту в сечі використовують реакцію Гріса. Сульфанілова кислота (1) у розведеній оцтовій кислоті з нітритом дає червоне забарвлення. При цьому сульфанілова кислота діазотується азотистою кислотою, а діазосполучення, що утворилося (2), з нафтиламіном (3) утворює азобарвник (4) червоного кольору:

HO3S	NH2		+ HNO + H+		HO3S	+	N + 2H		O
						N
			3				2
	1					2
				NH2					+
	+				HO3S	N	N		NH3
HO3S		+
	N N
			3					4

При тестуванні рН мають на увазі, що для сечі він змінюється в діапазоні 4,5 – 8,0 (норма рН 5–6). У перших тестах на рН сечі використовували лакмусовий папірець. Зараз використовують смужки паперу, змочені сумішшю метилового червоного і бромтимолового синього, що змінюють забарвлення з оранжевого в синє в діапазоні рН 5 – 9.

Для тест-визначення хлоридів у сечі використовують тест-смужки, змочені комплексом срібла з 2-(2-тіазолілазо)-п-крезолом, який утворюється у середовищі 2-(N-морфолін)етансульфоната і метанолу в присутності гуміарабіку. Для визначення хлорид-іонів у слині та інших рідинах організму з межею виявлення 2 мг/л використовують індикаторну реакцію з Ag2CrО4. Для тестування міді в сечі рекомендовані тест-смужки, що містять 4-(3,5-дибром-2-піридилазо)-N,N-діалкіланілін, аскорбінову кислоту, ПАР і буферні речовини (рН 4,5 – 7,5).

Відомі тест-методи виявлення парів алкоголю, наркотиків, отруйних і вибухових речовин. Визначення наркотичних речовин часто проводять у клінічній і судовій медицині. Склад політестів на наркотики представлений у табл. 19.3.

Таблиця 19.3. Тест-методи для визначення наркотиків

Вид наркотику	Склад реагентів		Колір
Марихуана,	Порошок міцного синього	Б;	Від оранжевого до
гашиш	суміш (1:3) хлороформ – ССl4		пурпурно-

311

							червоного
Опій,	макова	10%-ний розчин формаліну в					Фіолетове
соломка		сірчаній кислоті, CHCl3; 5%-ний					забарвлення
		розчин K2CO3					верхнього шару
Морфій, героїн,		2%-ний розчин формаліну в					Фіолетовий		(мор-
кодеїн,	проме-	сірчаній	кислоті,			Al2O3	фін, героїн), синьо-
дол,	амфета-	(нейтралізатор)					фіолетовий		(коде-
міни							їн),	червоний
							(промедол),
							оранжевий		або
							коричнево-бурий
							(амфетамін)
Барбітурати		5%-ний розчин Co(NO3)2 в					Бузковий
		ізопропанолі; 10%-ний розчин
		піридину в ізопропанолі
Героїн		Бромфеноловий		синій		у	Пурпурний
		буферному розчині (рН 5), CHCl3
Кокаїн		2%-ний	розчин		роданіду		Голубе забарвлення
		кобальту, CHCl3					нижнього шару
Амфетаміни		1%-ний розчин нітропрусиду					Темно-рожевий
		натрію в 5%-ному водному
		розчині ацетону; 2%-ний розчин
		K2CO3
Ефедрин		0,5 M водний розчин CuSO4; н-					Фіолетове
		бутанол; 10%-ний розчин K2CO3					забарвлення
							верхнього шару
ЛСД		5%-ний	розчин			п-	Червоно-
		диметиламінобензальдегіду				в	фіолетовий
		суміші	(1:1) етанолу		і H3PO4;
		Al2O3
Морфін,		0,3%-ний розчин молібдату					Фіолетовий (мор-
кодеїн, героїн		амонію в H2SO4; Al2O3					фін, героїн), темно-
							зелений (кодеїн)
Барбітурати		0,5%-ний розчин CuSO4 в 5%-					Голубе забарвлення
		ному розчині піперидину; CHCl3					нижнього шару

Ці тести виготовлені у вигляді поліетиленової піни з напівпрозорими реакційними контейнерами, двома скляними ампулами з хімічними реагентами і двома поліетиленовими пробками. При натисканні на пробки ампули руйнуються і їхній вміст надходить у реакційний контейнер, у який попередньо поміщена проба досліджуваного об'єкта. Деякі тести додатково забезпечені стандартними тюбиками-крапельницями з водними розчинами

312

карбонату калію різних концентрацій. Тест на опій і соломку маку забезпечений додатковим контейнером для екстракцій. Тести, що містять ампули з концентрованими кислотами, забезпечені ампулами з оксидом алюмінію для нейтралізації середовища.

Для швидкого виявлення 0,005 – 1 мг/л морфію в крові і сечі в ургентній медицині використовують папір, змочений розчином, що містить антитіла проти морфію, глюкозооксидазу, 4-хлор-1-нафтол, фосфат натрію, альбумін, кон’югат пероксидази з морфієм, глюкозу. У тесті на амфетамін, кокаїн, марихуану, морфій папір обробляють сумішшю основного нітрату вісмуту, KI, K2PtCl4. При тестуванні гашишу і марихуани силікагель імпрегнують міцним синім Б і NaOH.

19.4. Імунологічний тест вагітності

Імунологічна хімія дозволила створити велику кількість високочутливих тестів для швидкого аналізу під час операцій і для домашньої діагностики. Прикладом останнього є тест на наявність вагітності, що проводиться з використанням сечі. Всі подібні тести засновані на визначенні в сечі рівня людського гормону гонадотропіну, що з'являється в сечі жінки під час вагітності і може бути використаний для її раннього виявлення.

Принцип дії у всіх таких тестів абсолютно однаковий. Справа в тому, що із зиготи формується не тільки зародок, але й зародкові, а потім плодові, оболонки. Одна з оболонок – хоріон – виробляє власний гормон – хоріонічний гонадотропін. За допомогою тестів можна визначити вміст цього гормону в крові або сечі. Механізм визначення полягає в імунологічній реакції антиген-антитіло, що відбувається на поверхні паперової смужки. При наявності в досліджуваній рідині гонадотропіну відбувається каскадна активація імуноферментної реакції, у результаті якої досліджуваний матеріал (сеча) забарвлюється зазвичай в рожевий колір.

Антитіла до гонадотропіну нанесені у вигляді двох тонких ліній, одна з яких контрольна, і містить свідомо достатню кількість цього гормону. Тому при наявності в досліджуваній рідині (сечі) гонадотропіну відбувається забарвлення обох ліній, а при його відсутності - тільки однієї. Якщо жодна лінія не забарвилася, це означає, що тест дефектний, негідний для визначення вагітності.

Хоріонічний гонадотропін починає вироблятися із сьомої – восьмої доби вагітності, але діагностична його концентрація в сечі досягається тільки з десятої доби. І якщо умовно вважати, що тривалість лютеїнової фази в жінки 13-15 днів, то додавши з моменту овуляції 3 дні на можливе запліднення і ще 10 на досягнення діагностичного титру гонадотропіну, одержимо, що за допомогою тесту вагітність можна визначити з першого

313

дня затримки менструації або навіть за 1-2 дня до неї. Надійність таких тестів > 99%.

19.5. Сенсори в аналізі

Сенсорами (від лат. sensus – почуття) називають чутливі елементи невеликих розмірів, що генерують аналітичний сигнал, інтенсивність якого залежить від концентрації визначуваної речовини в об'єкті. На відміну від тест-методів, сенсори дозволяють проводити не візуальний, а інструментальний кількісний вимір вмісту речовини, пов'язаний з попереднім градуюванням приладу за стандартами.

Сенсори є основними елементами нового покоління аналітичних приладів, що включають пристрій для введення проби, чутливий елемент, обробку аналітичного сигналу і видачу кінцевого результату про концентрацію компонента. Для них характерні мала маса і габарити, автономний автоматизований режим роботи і мала витрата енергії.

Існує три типи сенсорів: фізичні, хімічні та біосенсори. В фізичних сенсорах під впливом аналізованої речовини змінюються електричні, теплові, магнітні або спектральні характеристики. Наприклад, для визначення СО2 використовуються кондуктометричні сенсори, засновані на вимірі електричної провідності водного розчину діоксиду вуглецю. Провідність аналізованого розчину визначається концентрацією іонів Н+ і НСО3–, що у свою чергу залежить від парціального тиску СО2. Збільшення електропровідності аналізованого розчину в порівнянні з холостим (без СО2) є аналітичним сигналом. В розділі 17 ми розглядали конструкцію ІЧсенсора на СО2, аналітичним сигналом в якому є зміна тиску в камері пневматичного детектора.

Відмітна ознака хімічних сенсорів і біосенсорів – наявність рецептора – шару молекул або частинок речовини, що беруть участь у хімічних, біохімічних або біологічних процесах, які протікають при контакті сенсора з визначуваним компонентом. Іншим необхідним елементом сенсора є перетворювач енергії зазначених аналітичних процесів в електричний або світловий сигнал. Далі цей сигнал обробляється в електронному блоці і подається на дисплей.

Прикладом біосенсорів можуть служити ферментні електроди – це датчики, у яких іоноселективний електрод покритий плівкою, що містить фермент, здатний викликати реакцію органічної або неорганічної речовини (субстрату) з утворенням речовин (іонів, молекул), на які реагує електрод. В основі роботи електрода лежить ферментативна реакція:

Визначувана речовина (субстрат) Фермент→ Іон (молекула)

В результаті реакції утворюється частинка, що спричиняє відгук електрода. Селективність ферментних електродів дуже висока, оскільки кожний фермент каталізує тільки якусь певну реакцію. На рис. 19.3

314

показана схема електрода для визначення сечовини СО(NH2)2 на основі ферменту уреази:

Рис. 19.3. Ферментний електрод для визначення сечовини: 1 – гель, що містить фермент уреазу; 2 – скляна мембрана, селективна до NH4+- іонів; 3 – внутрішній електрод порівняння; 4 – внутрішній стандартний розчин NH4+; 5 – субстрат

У шарі гелю, що містить уреазу, протікає реакція: CO(NH2)2 + 2H2O+ H+ Уреаза,буфер→2NH4+ + HCO3–

Концентрацію іонів амонію, що утворюються, вимірюють за допомогою NH4+-селективного скляного електрода. При постійній активності ферменту потенціал цього електрода є функцією логарифма активності CO(NH2)2.

В табл. 19.4 наведені інші приклади використання ферментних

електродів.
	Таблиця 19.4. Використання ферментних електродів				Індикаторний
	Субстрат	Фермент	Електрохі-
			мічно		електрод
			активна
			частинка		Скляний	рН-
	Пеніцилін	Пеніциліназа	Н+
					чутливий	NH4+-
	Сечовина	Уреаза	NH4+		Скляний
					чутливий
	Мурашина	Алкогольоксидаза	СО2		СО2- газовий
	кислота				Скляний	рН-
	Глюкоза	Глюкозооксидаза	Н+
					чутливий
	Фосфат-іон	Лужна фосфатаза	О2		Платиновий

315

Хімічні сенсори дають пряму інформацію про склад середовища без відбору проби і її якої-небудь попередньої підготовки. Вони можуть працювати автономно і зазвичай зв'язані із системою накопичення інформації і її обробки. На основі сенсорів конструюють сенсорні аналізатори, що представляють собою батарею окремих сенсорів, кожний з яких подає інформацію про вміст окремого компонента. За допомогою таких мультианалізаторів проводиться експресне визначення рівня електролітів крові і інших фізіологічних рідин, досліджується поведінка ліків, хімічно шкідливих речовин, наркотиків.

19.6. Ферментативні і імунохімічні методи

Методи визначення ферментів, їх субстратів і антитіл дозволяють вирішувати повсякденні задачі медичної діагностики, фармацевтичної та мікробіологічної промисловості. Головна перевага біохімічних методів – висока селективність, яка обумовлена специфічністю ферментативних та імунних процесів.

Ферменти – це білкові біологічні каталізатори з відносною молекулярною масою від 10000 до 2000000. Вони складаються з амінокислотних ланцюгів, в яких залишки амінокислот зв’язані пептидними зв’язками. Багато ферментів проявляють свою дію тільки якщо вони зв’язані з кофактором. Щоб розрізнити діючий фермент та його білкову частину, використовують терміни «холофермент» та «апофермент», відповідно.

В якості кофакторів можуть бути:

1.іони металів, наприклад, Zn2+ в алкогольдегідрогеназі та карбоксипептидазі, Mn2+ в фосфортрансферазі, іони заліза в цитохромах.

2.органічні молекули – коферменти (коензими), наприклад, никотинамідаденіндифосфатаза (рис. 19.4), переносник гідроксильних груп

іелектронів, або коензим А, переносник ацильних груп.

316

H2N	N	O	O- O		O-
						N+
	N	CH2	P	P	O
N					CH2	O
	HO OH	O	O		O	C
N	O				OH OH	NH2
Рис.	19.4.	Структурна			формула	коферменту
никотинамідаденіндифосфатаза (НАД+)

В організмі ферменти виконують роль каталізаторів біохімічних реакцій. Одна з особливостей ферментативних реакцій – явище насичення за субстратом, тобто при деяких умовах спостерігається відсутність залежності швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату. Рис. 19.5 ілюструє це явище.

Рис. 19.5. Вплив концентрації субстрату на початкову швидкість ферментативної реакції

Якщо представити графічно залежність початкової швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату, то при невеликих концентраціях спостерігається лінійна залежність (перший кінетичний порядок). Далі порядок реакції має проміжне значення між першим та нульовим і, нарешті, при високих концентраціях спостерігається нульовий порядок.

Пояснити насичення за субстратом можна з позицій кінетичної теорії ферментативних реакцій Міхаельса-Ментена. У відповідності з цією теорією фермент Е реагує з субстратом S з утворенням продукту Р відповідно схемі:

E + S ←k1 →ES

k−1

317

ES →k2 E + P

На першій, оборотній, стадії утворюється комплекс ферменту із субстратом. Після другої стадії фермент визволяється. На рис. 19.6 показано зміну концентрацій окремих учасників реакції від часу.

Рис. 19.6. Приблизний хід зміни концентрацій ферменту Е, субстрату S, продукту реакції Р та проміжного комплексу ES в залежності від часу

Результуючим рівнянням математичного апарату теорії є вираз для початкової швидкості утворення продукту ферментативної реакції:

V0 = k2 CE+[S] , KM [S]

де СE – загальна концентрація ферменту; [S] – рівноважна концентрація субстрату; KM – стала Міхаельса-Ментена

Значення сталої Міхаельса-Ментена наведені в табл. 19.5.

Таблиця 19.5. Стала Міхаельса-Ментена для деяких аналітично важливих ферментативних реакцій

Фермент	Субстрат	KM, мМ
Каталаза	H2O2	25
Гексокіназа	глюкоза	0,15
Глутаматдегідрогеназа	глутамат	0,12
Якщо концентрація субстрату	достатньо велика	[S] >> KM, то

результуюче рівняння спрощується:

V0 = Vmax = k2CE

В цих умовах швидкість реакції максимальна і залежить тільки від концентрації ферменту, але ж не субстрату (ми вже згадували явище насичення за субстратом). Таким чином, вимірювання швидкості реакції

318

можна використати для визначення концентрації ферменту. Прикладом може бути визначення ферменту GOT – одного з ферментів класу трансаминаз, який каталізує реакцію:

L-аспарагінова кислота + α-кетоглутарова кислота GOT →щавлевооцтова кислота + L-глутамінова кислота

Концентрація цього ферменту в сироватці крові людини є дуже важливим параметром, який характеризує протікання процесів метаболізму амінокислот.

При визначенні субстратів слід навпаки використовувати область концентрацій [S] << KM. В цьому випадку рівняння початкової швидкості утворення продукту ферментативної реакції перетворюється на вираз

V0	=	k2CE [S]	=	Vmax	[S] = const [S]
		KM		KM

Визначення субстратів за допомогою ферментативних реакцій широко використовується в клінічному, промисловому, екологічному аналізі та в інших областях (табл. 19.6).

Таблиця 19.6. Приклади використання ферментативних реакцій для визначення субстратів

Субстрат		Ферментативна реакція	Фермент-каталізатор
		Медицина:
Глюкоза		глюкоза + О2 + Н2О = D-	глюкозооксидаза
		глюконолактон + Н2О2
Етанол	(в	етанол + НАД+ = ацетальдегід +	алкогольдегідрогеназа
крові)		НАДН
		Промисловість:
Пеніцилін		пеніцилін + Н2О2 = пеніцилінова	пеніциліназа
		кислота
Катехол		катехол + О2 = дикарбонова	катехол-1,2-
		кислота	оксигеназа
		Екологія:
Фенол		фенол + О2 = о-бензохінон	поліфенолоксидаза

Способи детектування в ферментативних методах аналізу. В

деяких випадках хід протікання ферментативних реакцій можна контролювати безпосередньо, спостерігаючи за зміною концентрацій любого з її учасників. Так, для вимірювання скорості любої реакції з участю кисню можна використовувати кисневий датчик Кларка, а з участю іонів амонію – відповідний іоноселективний електрод.

319

Однак частіше використовують хімічні індикатори або додаткові індикаторні реакції. Так, для окисно-відновних реакцій як індикатор можна використовувати кофермент НАД+, оскільки УФ-спектри його окисленої (НАД+) та відновленої (НАДН) форм помітно розрізняються.

Використання індикаторних реакцій можна продемонструвати на прикладі визначення глюкози за допомогою глюкозооксидази (табл. 19.6). Одним з продуктів цієї реакції є пероксид водню. Додамо до системи додатковий реагент – о-дианізидин. Він безбарвний, однак у присутності пероксиду водню перетворюється до забарвленого продукту внаслідок реакції:

H C O	O CH				H3C O	O CH3
3	3
H2O2 + H2N	NH2				H2O + HN	NH
відновлена форма						окислена форма
(безбарвна)						(червона)

Продукт окислення – діімін – інтенсивно поглинає світло при 460 нм. Це можна використовувати для фотометричного контролю перебігу ферментативної реакції.

Ще один напрямок розвитку біохімічних методів аналізу базується на використанні імунохімічних процесів. В основі методів імунного аналізу лежать взаємодії антиген-антитіло. Імунний аналіз використовує унікальну специфічність антитіла, що зв'язує антиген, з метою селективно розпізнати і визначити речовини, які є антитілами або антигенами.

Антитіло являє собою білок зі специфічним доменом, що зв'язує антигени, наприклад гамма-глобулін. Антигени – це біополімери (головним чином білки і полісахариди з молекулярними масами більш ніж 1000), здатні викликати імунну відповідь, тобто які викликають розвиток імунологічних реакцій. Можна домогтися високої селективності імунного аналізу, тому що інші сполуки в пробі розпізнаватися не будуть. Антитіла являють собою один з головних класів білків, об'єднаних назвою імуноглобуліни. Антиген не обов'язково повинен бути білком; це може бути будь-яка макромолекула, що здатна індукувати імунну відповідь і, у такий спосіб викликати утворення антитіл проти неї.

При попаданні в організм людини або тварини чужорідної високомолекулярної сполуки (антиген) природного походження вступає в дію імунна система. Вона виробляє спеціальну речовину «протиотруту» (антитіло), яка здатна зв’язати чужу речовину і знешкодити її. В результаті реакції антигена (Ag) з антитілом (Ak) утворюється імунний комплекс:

320