18

Тема 1: мікроскоп. Мікроскопічні прилади. Гістологічна техніка.

Зміст

Техніка мікроскопії в світлових мікроскопах. Спеціальні методи світлової мікроскопії - фазовоконтрастна, темнопольова, люмінесцентна, інтерферентна, лазерна скануюча. Трансмісійна і скануюча електронна мікроскопія. Поняття про гістохімічні, радіоавтографії, імуноцитохімічні. Вітальні методи дослідження.

Основні принципи приготування препаратів для світлової і електронної мікроскопії, взяття матеріалу (біопсія, пункції, аутопсія). Фіксація, обезводнення, ущільнення об'єктів, приготування зрізів на мікротомах і ультрамікротомах. Види міпрепаратів - зріз, мазок, відбиток, плівки, шліф. Забарвлення і контрастування препаратів. Поняття про гістологічні барвники.

Мікроскопічна техніка.

Головні етапи цитологічного і гістологічного аналізу:

- вибір об'єкту дослідження

- підготовка його для вивчення в мікроскопі

- застосування методів мікроскопування

- якісний і кількісний аналіз отриманих зображень

Кількісні методи дослідження - морфометрія, денситометрія, цитофотометрія, спектро-флуорометрія.

Мікроскопічні методи дослідження мають величезне значення для теорії і практики медицини як спосіб вивчення гістологічних структур в нормі, експерименті і патології.

Світловий мікроскоп. Мікроскоп – оптичний прилад, призначений для отримання збільшених зображень біологічних об'єктів і деталей їх будови, не видимих неозброєним оком.

Мікроскоп складається з оптичних і механічних частин. Оптичні частини мікроскопа: об'єктиви, окуляр, дзеркало і конденсор з ірисовою діафрагмою. Механічні частини мікроскопа: підстава, тубусотримач, тубус, револьвер, предметний столик, механізми макро- і мікрогвинта, механізм переміщення конденсора

Оптичні частини мікроскопа.

Об'єктив – основна оптична частина мікроскопа, яка створює зображення препарату. Об'єктив є системою лінз в металевій оправі, де розрізняють фронтальну – головну або збільшувальну лінзу, найближчу до об'єкту, яка будує зображення і коректувальні – вони усувають аберацію фронтальної лінзи. Об'єктиви підрозділяються:

А) по ступеню збільшення на об'єктиви малих збільшень (збільшення 10), об'єктиви середніх збільшень (збільшення 40), об'єктиви великих збільшень (збільшення 90)

Б) по ступеню досконалості виправлень аберації (спотворень) на монохромати (призначені для роботи при монохроматичному освітленні), ахромати (хроматична аберація виправлена для 2 кольорів спектру), апохромати (хроматична аберація виправлена для 3 квітів спектру); планмонохромати, планахромати, планапохромати ( виправлена кривизна поверхні зображення)

В) по властивостях на сухоповітряні і іммерсійні. При використанні сухоповітряних об'єктивів між препаратом і об'єктивом повітряний простір, при іммерсійних між препаратом і об'єктивом знаходиться рідина ( іммерсійне масло, вода). Відповідно іммерсійні об'єктиви ділять на водні і масляні. Отримання максимального збільшення можливе тільки за допомогою іммерсійного об'єктиву ( як правило, об'єктиву із збільшенням 90). Імерсійні об'єктиви розраховуються на роботу з покривними стеклами не товщі 0,17 мм.

Окуляр – оптична система, використовувана для розгляду зображення, побудованого об'єктивом. Простий окуляр (Гюйгенса) складається з двох плоскоопуклих лінз, обернених опуклою поверхнею у бік об'єктиву. Між лінзами знаходиться діафрагма з постійним отвором. До діафрагми кріпиться стрілка – покажчик. Верхня лінза іменується очною, на її оправі вказується збільшення окуляра. Нижня лінза отримала назву польової. Окуляр зазвичай збільшує зображення в 5-25 разів

Дзеркало – направляє потік світла через конденсор на препарат. Має плоску і увігнуту поверхні, які використовуються залежно від ступеня освітлення.

Конденсор – збирає промені світла і фокусує їх на препарат, забезпечуючи достатнє і рівномірне освітлення останнього. Конденсор складається з двох лінз: нижньою двоопуклою і верхньою плоскоопуклою. За допомогою конденсора регулюють ступінь освітлення об'єкту, що вивчається.

Механізм переміщення конденсора дозволяє змінювати його положення і тим самим збільшити або ослабити освітлення препарату.

Ірисова діафрагма, вмонтована в конденсор, служить для зміни ступеню освітленості препарату.

Механічні частини мікроскопа.

Підстава – використовується для стійкого положення мікроскопа на столі.

Тубусотримач – об'єднує в єдине ціле всі частини мікроскопа, оскільки останні прямо або побічно з'єднуються з ним і для його транспортування.

Предметний столик – служить для розміщення препарату. У центрі столика отвір. Переміщення наочного столика в горизонтальній площині проводиться двома центровочними гвинтами, що знаходяться в підставі столика.

Револьвер – складається з двох (нерухомою і рухомою) дископодібних пластин. У останній укріплені об'єктиви. Служить для швидкої зміни об'єктивів.

Тубус – порожниста металева трубка, у верхній частині якої встановлюється окуляр, а до нижньої кріпиться револьвер.

Макрогвинт – служить для грубого фокусування різкості зображення.

Мікрогвинт – необхідний для тонкого наведення на різкість і для вивчення препарату по товщині.

Найважливішими характеристиками мікроскопа є:

1) збільшення – здатність розсовувати промені, що йдуть від об'єктиву. Воно визначається відношенням лінійних розмірів зображення до лінійних розмірів об'єкту. Збільшення залежить від кривизни лінзи - чим більше кривизна, тим більше збільшення. Загальне збільшення мікроскопа визначається множиною збільшень об'єктиву і окуляра. При цьому треба пам'ятати, що об'єктив збільшує об'єкт, що вивчається, а окуляр – зображення, отримане за допомогою об'єктиву, не додаючи до нього нових деталей, не виявлених об'єктивом.

2) якість зображення – характеризується чіткістю зображення і залежить від ступеня виправлення основних оптичних недоліків лінзи – сферичної і хроматичної аберації.

Сферична аберація – сильніше заломлення променів, що йдуть через периферичні зони лінзи в порівнянні з тими, що пройшли через її центральні ділянки. В результаті сферичної аберації зображення деталей об'єкту стає нечітким, розпливчатим. Зменшити сферичну аберацію можна шляхом підбору розсіюючих і збірних лінз різних по кривизні.

Хроматична аберація – розкладання променів білого кольору на спектр, унаслідок неоднакового заломлення променів з різною довжиною хвилі. Для цього виду аберації характерне спотворення кольору і зменшення чіткості зображення. Виправлення хроматичної аберації можливе при поєднанні лінз, виготовлених з різних видів оптичного скла, що мають неоднакові показники заломлення. Цей принцип використовується при конструюванні об'єктивів мікроскопа. У зв'язку з цим розрізняють ахроматичні системи з меншим ступенем виправлення хроматичної аберації і апохроматичні, де остання виправлена більшою мірою.

Інші види аберації – кома, астигматизм, дисторсія мають менше значення в практиці мікроскопування

3) роздільна здатність – характеризує здатність лінз давати роздільне зображення найбільш дрібних деталей об'єкту. Межа дозволу – це найменша відстань між двома точками об'єкту, при якому вони сприймаються роздільно. Роздільна здатність для світлового мікроскопа приблизно рівна половині довжини хвилі джерела світла і складає приблизно 0, 2 мкм.

Спеціальні методи мікроскопії.

Темнопольовий мікроскоп – застосовується для вивчення прозорих, слабо заломлюючих світло об'єктів, не видимих при освітленні звичайним способом. Для створення темнопольового освітлення використовуються спеціальні конденсори тебагато поля. Принцип освітлення полягає в тому, що промені прямують на об'єкт, не допускаючи попадання прямих променів в об'єктив. Дослідник спостерігає частини зображення, що світяться, на темному фоні. Межею можливостей такого способу мікроскопування є визначення частинок до 2 нм. Істотний недолік – неможливість визначити форму і внутрішню будову спостережуваних частинок.

Фазовий – котрастний мікроскоп – застосовується для вивчення малоконтрастних прозорих (зокрема, живих або нефарбованих) об'єктів, які майже не поглинають світла, тобто не змінюють амплітуду світлової хвилі, але змінюють фазу хвилі, що проходить. Проте око не може реєструвати фазових змін. За допомогою спеціального конденсора і об'єктиву вони штучно перетворюються на амплітудні, які сприймаються оком. В результаті цього створюється контрастне, чітке зображення нефарбованих структур.

Різновидами фазово-контрастного мікроскопа є інтерференційний мікроскоп, який призначений для кількістного визначення маси тканини, і диференціальний інтерференційний мікроскоп (з оптикою Номарського), який спеціально використовується для вивчення рельєфу поверхні клітин і інших біологічних об'єктів.

Фазово-контрастний і інтерференційний мікроскопи дозволяють вивчати живі клітини. У них використовується ефект інтерференції, що виникає при комбінації два наборів хвиль, який створює зображення мікроструктур. Перевагою фазово-контрастної і інтерференційної мікроскопії є можливість спостерігати клітини в процесі руху і мітозу. При цьому реєстрація руху клітин може проводитися за допомогою цейтраферної (покадрової) мікрокінозйомки.

Поляризаційний мікроскоп – виявляє в гістологічних об'єктах ізо- і анізоструктури (одинарне і подвійне променезаломлення в біологічних об'єктах). Для отримання поляризованого променя використовують, зокрема, призму Ніколя, що поміщається між джерелом світла і об'єктом. Інша призма – аналізатор знаходиться в обоймі, що обертається, між об'єктивом і окуляром. При повороті призми аналізатора на 90 градусів в полі зору залишаються видимими тільки анізотропні структури. Методом виключення визначаються ізотропні структури, які видно при нульовому положенні призми. Зображення препарату розглядається через окуляр.

Ультрафіолетовий мікроскоп – дає можливість зменшити вирішувану відстань 0,1 мкм унаслідок застосування ультрафіолетових променів. Як джерело використовують ртутно-кварцові лампи. Вся оптика мікроскопа, а також покривні і наочні стекла готуються з кварцу. У основі ультрафіолетової мікроскопії лежить виборче поглинання біологічними тканинами і клітинами короткохвильового випромінювання, унаслідок чого мікроскопування ультрафіолетових зображень дозволяє побачити їх структуру. Отримане в ультрафіолетових променях, не видиме оком зображення, перетвориться у видиме за допомогою реєстрації на фотопластині або шляхом застосування спеціальних пристроїв (люмінесцентний екран, електронно-оптичний перетворювач).

Люмінесцентний (флюоресцентний) мікроскоп – використовується для вивчення розподілу ряду хімічних компонентів в гістологічних структурах. Основою для створення цього приладу послужило явище люмінесценції, тобто збудженого свічення деяких біологічно важливих з'єднань. Будь-яка клітина живого організму володіє флюоресценцією, проте вона зазвичай буває надзвичайно слабкою. Наведена (штучна) люмінесценція виникає при обробці препаратів спеціальними барвниками – люмінофорами (акридіновий жовтогарячий). Їх концентрація настільки мала, що вони не впливають на склад і структуру препарату, а також не порушують життєдіяльність біологічних об'єктів. Це дає можливість проводити вітальні спостереження. Відповідно основ перевагою методу флюоресцентної мікроскопії є можливість спостережень цитологічних об’єктів, у тому числі і проведення на живому не фіксованому матеріалі деяких цито- і гістохімічних реакцій, причому в цьому застосуванні метод володіє високою чутливістю і специфічністю.

Електронний мікроскоп - дає можливість отримати зображення об'єктів, величина яких в середньому має близько 0,1-0,7 нм. Така висока роздільна здатність пояснюється застосуванням електронних променів. Джерелом електронів є електронна лампа без оболонки. Вольфрамова нитка катода під впливом нагріву випромінює потік електронів, який прямує в тубус. В умовах вакууму електронні промені в магнітному полі поводяться подібно до променів видимого світла в скляній призмі. Тому електромагніти електронного мікроскопа називають лінзами. Розрізняють конденсорна, об'єктивна і проекційна лінзи. Між конденсором і об'єктивом поміщають об'єкт. Електронний пучок спочатку фокусується конденсорною магнітною лінзою. Велика частина електронів, проходячи через об'єкт, фокусується другою магнітною лінзою – об'єктивною, яка дає збільшене зображення об'єкту. Це зображення збільшується третьою магнітною лінзою – проекційною. Електрони, які проходять через об'єкт, викликають свічення екрану, покритого люмінофором, проводячи на нім зображення об'єкту, тобто зображення виходить на люмінісцентному екрані. Його фотографують і, таким чином, предметом вивчення є електронна мікрофотографія. За допомогою електронного мікроскопа стало можливим вивчення ультраструктури клітин і їх похідних, макромолекул, вірусів і ін. субмікроскопічних утворень.

В даний час існують два типи електронних мікроскопів:

- растровий електронний мікроскоп

- електронний мікроскоп, що просвічує.

Так звані растрові (скануючі) електронні мікроскопи дозволяють отримати об'ємне зображення об'єктів, що вивчаються. Растровий електронний мікроскоп працює за принципом сканування електронним мікрозондом досліджуваного об'єкту, тобто послідовно «обмацувати» сфокусованим електронним променем окремі точки поверхні.

Головним достоїнством растрової електронної мікроскопії є велика глибина різкості, широкий діапазон безперервної зміни збільшення і висока роздільна здатність.

Електронний мікроскоп, що просвічує, дозволяє отримати плоске зображення досліджуваного об'єкту.

Мікрометр - використовується для вимірювання лінійних розмірів мікроскопічних об'єктів.

Контрольні питання

1. Механічні частини мікроскопа: будова, призначення.

2. Оптичні частини мікроскопа: будова, призначення.

3. Освітлювальний апарат мікроскопа: будова дзеркала і конденсора.

4. Основні властивості лінз мікроскопа. Види аберації.

5. Види об'єктивів і окуляра, їх особливості.

6. Визначення збільшення і роздільної здатності мікроскопа.

7. Основні правила мікроскопування гістологічних препаратів.

8. Принцип дії і призначення ультрафіолетового, люмінесцентного, і електронного мікроскопів.

Питання, винесені на СРС

1. Принцип дії і призначення фазово-контрастної, інтерференційної, поляризаційної, темнопольової мікроскопії.

2. Техніка вимірювання мікроскопічних об'єктів.

Основна література

1. Луцик О.Д. Іванова А.Й., Кабак К.С. Гістологія людини. Львів: Мир, 1992. – С.8-9.

2. Гістологія / Під ред. Ю.И.Афанасьева, Н.А.Юриної. М.: Медицина, 2001. С.15-18.

3. Гістологія / Під ред. Ю.И.Афанасьева, Н.А.Юриної. М.: Медицина, 2001. С.10-16.

Додаткова література

1. Лабораторні заняття по курсу гістології, цитології і ембріології / Під. Ред. Ю.И.Афанасьева. М.: Вища школа. 1990. С. 7-10.

2. Напханюк В.К., Сервецкий К.Л. Практикум по цитології, загальній гістології і ембріології. Навчальний посібник. Одеса, 1999. С. 8-15

3. Практикум по гістології, цитології і ембріології / Під. Ред. Н.А.Юриної, А.И.Радостиної. М.: Вид-во УДН. 1989. С. 12-17.

4. Методичні рекомендації кафедри.

Методи, що застосовуються в гістологічній техніці:

1. Прижиттєві.

2. Посмертні.