БХ - 3 семестр / ()Лекции / ()Общие / Белки / Глютатион пероксидаза

Глютатион пероксидаза

Принцип работы. Глютатион перексидаза катализирует окисление GSH в GSSG перекисью водорода:

GSH peroxidase

2GSH + Н2О2 ----------------------GSSG + Н2О

В этой пробе,скорость образования восстановленного глютатиона измеряется как значение восстановленного глютатиона

GR

GSSG + NADPH + H+ ----------------------2GSH + NADP+

Окисленный NADFH определяется при 340нм. ( измеряется).

Азид натрия добавляется в реакционную смесь для инактивации каталазы, которая разрушает перекись водорода.

Феррицианид-цианидный раствор использовался для приготовления гемолизата, чтобы уменьшить взаимодействие между Нb и NADFH. Хотя такое взаимодействие не будет количественно значимым в отсутствие красителя, но при его использовании получают более линейные результаты.

Процесс работы:

Реагенты вносятся в кюветы с критическим объемом меньше, чем 1 мл.

При большом числе проб, реагенты добавляются в кюветы в количествах :

Фон ( пустышка) проба

КРО4 буфер, рН 7.0, 1 М 100 100

GSH , 0.1 М --- 10

EDTA. 02 M ( нейтр) 20 20

Глютатион редуктаза, 10 Y/мл 100 100

Натрий азид, 0.4М 10 10

NADFH, 2мМ 100 100

1 : 20 феррицианид- цианид гемолизат 20 20

Н2О 640 630

Проводят преинкубацию при 37 градусах в течение 10 минут, затем добавляют

Перекись водорода Н2О2 10мМ 10 10

Добавляют один V эритроцитов к 19 V раствора, содержащего 100 мг NaCN и 300мг K3(FeCN)6 в 1 литре.

Измеряют оптическую плотность ( ОD) 0.9мл при разведении 1:10 одномолярного фосфатного буфера, рН 7.0 при 230 нм ( ОD1). Добавляют 0.1 мл при 1: 100 разведении 30% раствора перекиси водорода и измеряют ОD2. Поскольку мМ коэффициент экстинкции перекиси водорода при 230 нм -- - 0.071, то концентрация ( С) перекиси при разведении раствора 1 :100 будет равна :

141 ( OD1—OD2) мМ. 10 мМ разведение получают, растворяя 1 мл, разведенного 1:100 раствора в 10 мл воды ( С/ 10мл)

Снижение ОD системы измеряют против пустышки при 340 нм.

Дополнительные требования к фону ( пустышке ). Раствор феррицианид- цианида необходим для коррекции неферментативного окисления GSH и Н2О2. .Эта величина будет приблизиьельно на уровне 0.015 к 0.02 OD единиц / мин.

Комментарии

Трис- солянокислый буфер , рН 8, который используется для большинства других ферментов, не может использоваться здесь т.к повторяется фоновый сигнал. Скорость реакции сильно зависит от концентрации перекиси водорода.. 10 мМ перекись должна готовиться ежедневно из 30% раствора. Рстворы глютатиона должны быть свежими, но даже и в таком состоянии они всегда содержат некоторое количкство окисленного глютатиона. Это результат действия NADFH. Если глютатион содержит много окисленный формы, то никаких изменений не будет отмечаться при добавлении перекиси, или они быстро исчезают после появления.. В этом случае нужен более чистый раствор восстановленного глютатиона, или дополнительное добавление NADFH опытную пробу.

Вычисления, нормальные значения и интерпретация результатов.

Фоновое значение должно вычитаться из значений в присутствии гемолизата. Один моль NADFH окисляется с уменьшением каждой молекулы перекиси.

Содержание этого фермента повидимому будет ниже у АСD, красных клеток, чем у красных клеток крови , собранных в присутствии ЭДТА или гепарина.Красные клетки здорового взрослого человека, собранные при АСD содержат 5.32 +--1.79 IY глютатион пероксидаза/ г Нb ( значение +- стандаротное отклонение ). Недостаток глютатион пероксидазы наблюдается при неспецифической гемолитической анемии. Предполагалось, что низкий уровень этого фермента, в красных клетках новорожденных , имеет значение при развитии гемолитической анемии у новорожденных.

Глютатион редуктаза

Глютатион редуктаза катализирует восстановление окисленного GSSG NADFH и NADH в восстановленную форму GSH.

NADFH ( NADH) + H+ + GSSG ------------- NADP+ ( NAD ) + GSH

Активность фермента определяется спектрофотометрически при 340 нм при последующем окислении. Глютатион редуктаза ( GR) является флавиновым ферментом, было найдено, что он не полностью активируется FAD в здоровых гемолизатах. Полная активация апофермента требует преинкубации фермента с FAD. Это должно быть сделано перед добавлением GSH или NADFH в реакционную систему. Снижение ОD при 340 нм ( 37 градусах ) в системе без FAD, измеряется против фона не содержащего FAD. Пробы с FAD измеряются соответственно против фона, сод-го

FAD.

Процедура:

без FAD с FAD

фон( мкл) проба ( мкл) фон( мкл) проба( мкл)

трис-НСl, рН 8.0, 1М 50 50 50 50

EDTA, 0.2 М ( нейтр) 10 10 10 10

1 : 20 водный

гемолизат 10 10 10 10

вода 880 780 780 680

FAD. 10 мМ --- --- 100 100

Инкубация при 37 градусах 10 минут

GSSG, 0.033 М ( нейт) --- 100 --- 100

Инкубация при 37 градусах 10 минут

NADFH 2 мМ

(спектр.Стандартиз). 50 50 50 50

Дополнительные требования к фону--- нет.

Фермент становится более активным в первые несколько минут. 1 моль NADFH окисляется с уменьшеним каждого моля окисленного GSSG. (Используются приложения на стр 32.

Ферментативная активность ( Е) – Y (единиц) рассчитывается на на 1 г Hb крови.

Е = 100* А /Нв ( где А число единиц фермента в 1 мл, а Нв – конц.-я

в 100мл гемолизата.

В случае NAD и NADF ферментативных проб, в которых 1 моль кофермента окисляется или восстанавливается на каждый моль, потребляемого S считают:

А= дельта ОD /6.22 * Vc/Vн,

Где дельта OD изменение оптической плотности в минуту при 340 нм., а Vc и Vн соответственно объемы кювет- Vн объем кюветы с гемолизатом.

Эритроциты здорового человека содержат 5.68 +- 1.52 IU GR/g Hb ( значение стандартных отклонений) без ( FAD ), и 7.44 +- 1.63 IU GR/g Hb с добавлением FAD.

Низкая активность GR служит мерой оценки недостатка рибофлавина в питании.