Документ

Общая характеристика продуктивного процесса

Циклы репродукции всех вирусов имеют общие черты. В течение некоторого времени после заражения клетки в ней практически не удается обнаружить вирусных частиц. Этот период известен как фаза эклипса (затмения). В это время вирусная частица находится в клетке в дезинтегрированном состоянии. Период эклипса найден у всех без исключения вирусов, и его наличие в настоящее время рассматривается как один из критериев для отнесения того или иного биологического объекта к вирусам.

За периодом эклипса следует период созревания - интервал, в течение которого вирионы потомства накапливаются внутри клетки с экспоненциальной скоростью. Фаза созревания завершается выходом потомства из клетки, что знаменует собой окончание латентного (инкубационного) периода - минимального промежутка времени, в течение которого вирусные частицы отсутствуют в окружающей клетку среде. Цикл репродукции вирусов продолжается от 30-40 мин (у многих бактериофагов) до более чем 40 ч (герпесвирусы). При этом урожай вирионов широко варьирует и иногда достигает десятков тысяч частиц в расчете на одну клетку (вирус полиомиелита).

Общие представления о цикле репликации вирусов

Чтобы заразить клетку, вирион должен связаться с ней, затем проникнуть сквозь клеточную поверхность. Его геном должен приобрести доступность для ферментов, обеспечивающих транскрипцию и репликацию генома.

Цикл репликации вирусов можно разложить на ряд стадий:

Прикрепление вируса к клетке

Прикрепление (адсорбция) вируса представляет собой специфическое связывание вирионного белка (антирецептора) с молекулой клеточного рецептора. Классическим примером антирецептора является

гемаглютенин вируса гриппа. Некоторые сложные вирусы (герпесвирусы) используют более чем один рецептор.

Подавляющее большинство рецепторов и все антирецепторы, идентифицированные к настоящему времени, относятся по своей химической природе к гликопротеидам.

Вирус адсорбируется на клетке вначале обратимым образом и может быть элюирован с нее. Затем адсорбция принимает необратимый характер, что связано с изменением как вируса, так и клетки.

Чувствительность клетки (т.е. ее восприимчивость к тому или иному вирусу) определяется наличием рецепторов, однако восприимчивость клеток не следует путать с пермиссивностью - способностью их обеспечивать размножение вируса.

Одним из хорошо изученных примеров вирус-рецепторного взаимодействия является адсорбция на клетке вируса гриппа. Белок гемагглютенин образует один из двух типов гликопротеидных шипов на поверхности вирусной частицы. Второй тип шипов формирует белок нейраминидаза. Каждый гемагглютениновый шип состоит из трех молекул, в то время как нейраминидазный шип является тетрамером. Гемагглютениновые шипы отвечают за связывание вируса с рецепторами, которые представляют собой сиаловые кислоты. Из-за сравнительно низкой специфичности такого взаимодействия, вирусы гриппа способны связываться с клетками самых разнообразных типов (в том числе с эритроцитами, вызывая их агглютинацию).

Нейраминидаза является эстеразой, которая отщепляет сиаловую кислоту от углеводной цепи. Это очень важно для вируса гриппа. Поскольку рецепторы для этого вируса широко распространены, вирус часто присоединяется к непермиссивным клеткам и даже к их обломкам. Для того чтобы десорбироваться с таких неподходящих клеток, вирус гриппа способен отделяться от рецепторов в результате отщепления нейраминовой кислоты от полисахаридной части рецепторной молекулы.

В большинстве случаев наличие (или отсутствие) рецепторов на поверхности клетки определяет тропизм вируса, т.е. тип клеток-хозяев, в которых вирус способен реплицироваться. Гораздо реже такую роль играет блокирование репликации на ее более поздних стадиях. Другими словами, самая первоначальная стадия взаимодействия между вирусом и клеткой имеет важнейшее влияние на вирусный патогенез и определяет судьбу вирусной инфекции.

Проникновение вируса в клетку

Этот процесс требует затрат энергии. Считается, что проникновение происходит в результате одного из следующих событий:

1. Транслокации вируса целиком через клеточную мембрану. Такой способ вирусы используют редко. Процесс опосредуется белками, находящимися в составе вирусного капсида, и специфическими мембранными рецепторами;

2. Виропексиса (рецепторного эндоцитоза), в результате которого вирус накапливается в цитоплазматических вакуолях. Это наиболее обычный способ проникновения вирусов в клетки. Он не требует участия каких-либо специальных вирусных белков, кроме антирецепторов.

Эндоцитарные вакуоли могут перемещаться внутри клетки, перенося находящиеся в ней вирусы вплоть до ядра;

3. Слияния оболочки вириона с клеточной мембраной. Этот процесс происходит или непосредственно на поверхности клетки, или следует за эндоцитозом в цитоплазматической вакуоли и требует наличия в составе вирусной оболочки специфического белка слияния. Под действием этого белка происходит слияние вирусной оболочки с мембраной клетки (или вакуоли), в результате чего вирусная оболочка и встроенные в нее белки становятся частью клеточной мембраны (или мембраны вакуоли), а капсид, содержащий генетический материал, проникает в цитоплазму и вызывает инфекцию.

С помощью первых двух способов в клетку проникают простые вирусы. Сложные вирусы используют варианты третьего механизма.

Раздевание вируса

Раздевание - обобщенное наименование событий, которые происходят после проникновения вируса в клетку и завершаются полным (или частичным) разрушением вирусного капсида и появлением в цитоплазме вирусного генома в форме, появлением в вирусного генома в форме, способной к экспрессии.

В определенном смысле удаление вирусной оболочки, которое происходит во время слияния вирусной и клеточной мембран, уже можно рассматривать как часть процесса раздевания. Слияние вирусной оболочки и эндосомальной мембраны контролируется вирусными белками слияния. Следует отметить, что эндоцитоз таит для вирусов определенную опасность, поскольку, если вирус задерживается в эндосоме надолго, то необратимо повреждается лизосомальными ферментами.

Чем заканчивается стадия раздевания - зависит от вида вируса. В случае адено- и герпесвирусов клеточные ферменты разрушают капсид до ДНК или комплекса ДНК с основным (нуклеокапсидным) белком. У реовирусов удаляется только часть капсида, что не мешает, однако, вирусному геному экспрессировать все свои функции.

Стратегия репликации генома и экспрессия генов

Важной особенностью вирусов, отличающей их от других организмов, является то, что компоненты вируса синтезируются клеток раздельно, а

Затем соединяются в зрелую вирусную частицу. Такой способ размножения носит название дизъюнктивного.

Ключевым моментом в репликации вирусов является использование для синтеза вирусных белков клеточной белоксинтезирующей системы. При этом основная трудность состоит в том, что в клетке - ни в ядре, ни в цитоплазме нет ферментов, необходимых для синтеза мРНК на вирусных РНК. Кроме того, в цитоплазме нет ферментов, способных транскрибировать вирусную ДНК. В связи с этим клеточную транскриптазу для синтеза вирусных мРНК могут использовать только ДНК-содержащие вирусы, способные проникать в ядро. Все остальные вирусы вынуждены создавать собственные ферменты для синтеза мРНК.

Еще одна сложность заключается в том, что белоксинтезирующий аппарат эукариот способен транслировать только моноцистронные мРНК (он не распознает участки инициации внутри молекул мРНК). Как результат, вирусы вынуждены синтезировать либо индивидуальные мРНК для каждого гена (моноцистронные мРНК), либо мРНК, кодирующие большой полипротеин, который затем расщепляется на отдельные белки.

Стратегия любого вируса после проникновения в клетку направлена на синтез собственных белков (транскрипция и трансляция) и дочерних вирусных геномов (репликация). Способ решения этих задач зависит от природы вирусного генетического аппарата. В этом отношении все вирусы разделяют на семь групп.

Группа I (двухцепочечная ДНК). Группу составляют вирусы, инфицирующие: бактерии, высших животных, насекомых, эукариотические водоросли, грибы.

Эти вирусы обладают: линейными геномами, циркулярно пермутированными линейными геномами, линейными геномами с ковалентно замкнутыми концами.

Группа II (одноцепочечная ДНК). Эта группа включает вирусы, инфицирующие: бактерии, млекопитающих, птиц, растения.

Вирусы обладают: линейным однокомпонентным геномом, кольцевым однокомпонентным геномом, кольцевым двухкомпонентным геномом, кольцевым многокомпонентным (>3) геномом.

Репликация этих вирусов протекает в ядре через образование репликативной

формы - репликативного и нтермедиата, представляющего собой двухцепочечную ДНК, которая образуется вскоре после начала инфекции при участии (почти всегда) клеточных ДНК-полимераз.

Группа III (двухцепочечная РНК).

Группа объединяет вирусы, инфицирующие: бактерии, животных, растения, насекомых, позвоночных и беспозвоночных, грибы.

Вирусы обладают геномами: однокомпонентным, двухкомпонентным, трехкомпонентным, многокомпонентным (10-12 сегментов).

Большинство вирусов этой группы имеют сегментированный геном. Все фрагменты генома находятся в составе одной вирусной частицы.

Геномы вирусов этой группы реплицируются в цитоплазме клетки-хозяина по консервативному механизму с помощью вирионной РНК-зависимой РНК-полимеразы. При этом двухцепочечная РНК транскрибируется в моноцистронные мРНК, которые выполняют две функции:

• Транслируются, обеспечивая синтез вирусных белков;

• Служат матрицами для синтеза комплементарных дочерних цепей, что ведет к образованию двухцепочечных сегментов генома.

Группа IV (одноцепочечная (+)РНК)

Эта группа включает вирусы, инфицирующие: эубактерии,

вирусы насекомых, грибов, растений, позвоночных.

Вирусы обладают разнообразными видами геномов

Эти вирусы размножаются в циоплазме и у них имеется несколько вариантов экспрессии генома. В качестве основного варианта рассмотрим репликацию пикорнавирусов. Их геномные РНК выполняют две функции. Во-первых, они функционируют как мРНК - после проникновения в клетку связываются с рибосомами и целиком транслируются, образуя полипротеин. Затем полипротеин с помощью специфических клеточных и вирусных протеаз расщепляется на функциональные белки. Во-вторых, геномная РНК выполняет функцию матрицы для синтеза на ней комплементарной (-)РНК при участии РНК-полимеразы, появляющейся в клетке в результате расщепления полипротеина. При этом образуется репликативный интермедиат, формирующий молекулы дочерних (+)РНК, которые могут, в свою очередь, использоваться в качестве мРНК или включаться в состав вирионов.

Группа V (одноцепочечная (-)РНК.

Вирусы этой группы инфицируют: позвоночных, позвоночных и членистоногих, растения и членистоногих.

Для вирусов с геномной одноцепочечной негативной РНК характерно то, что геномная РНК выполняет две матричные функции.

Во-первых, она используется для транскрипции и, во-вторых, для репликации. В связи с тем, что для синтеза мРНК должна транскрибироваться вирусная РНК, а в клетке-хозяине соответствующего фермента нет, все вирусы с негативным геномом содержат в вирионе собственную РНК-зависимую РНК-полимеразу - транскриптазу.

Первым событием после проникновения вируса в клетку является транскрипция в цитоплазме вирусного генома, в результате чего накапливаются моноцистронные мРНК, каждая из которых кодирует один белок. Новосинтезированные вирусные белки, в свою очередь, начинают репликацию. Они катализирую! образование полноразмерной (+)РНК, служащей матрицей для синтеза на ней геномной (-)РНК потомства.

Итак, главное в репликации вирусов с негативной геномной РНК заключается в том, что она функционирует как матрица и для транскрипции, и для репликации. Отсюда следует, что:

1. Вирус должен вносить в клетку при заражении транскриптазу;

2..«голая» РНК, изолированная у из вирионов, неинфекционна;

3. Синтезируемые мРНК имеют длину одного гена, т.е. они кодируют один белок.

Группа VI (одноцепочечная (+)РНК, имеющая в ре пли кати в ном цикле ДНК в качестве интермедиата).

Вирусы этой группы инфицируют только позвоночных и представлены единственным сем. Retroviridae.

Геном вирусов - монолитный. Его уникальность заключается в том, что он диплоидный (представлен димерной одноцепочечной РНК).

Единственная известная функция геномной РНК - матричная функция для синтеза ДНК. Поскольку клетки-хозяева не имеют для этого соответствующего фермента, вирус кроме генома содержит еще и РНК-зависимую ДНК-полимеразу - обратную транскриптазу, а также смесь тРНК хозяина, которые при синтезе ДНК служат в качестве затравки.

В цикле репродукции вирусов можно выделить ряд основных стадий:

• Синтез в цитоплазме ДНК-копии, комплементарной по отношению к РНК. Эта стадия завершается образованием кольцевой одноцепочечной молекулы ДНК, связанной водородными связями с линейной геномной РНК.

• Расщепление геномной РНК нуклеазой, атакующей только РНК в составе гибридов ДНК/РНК.

• Синтез комплементарной копии вирусной ДНК. Эта стадия осуществляется при участии вирионной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы.

• Перемещение кольцевой двухцепочечной вирусной ДНК из цитоплазмы в ядро, где она интегрирует в геном клетки-хозяина.

• После интеграции в геном хозяина вирусная ДНК (провирус) попадает под контроль клетки и транскрибируется транскриптазой клетки-хозяина точно так же, как другие клеточные гены. Продуктом транскрипции является молекула мРНК, равная по длине геномной РНК. Эта РНК транслируется для синтеза структурных белков и ферментов, а также используется в качестве геномов дочерних популяций.

• Самосборка вирусных нуклеопротеидов происходит в цитоплазме, а созревание вирусных частиц происходит на клеточной оболочке, откуда они отделяются почкованием.

Группа VII (двухцепочечная ДНК, имеющая в репликативном цикле РНК в качестве интермедиата.

Этот класс вирусов включает сложные вирусы, содержащие в составе вириона кольцевые двухцепочечные ДНК, которые реплицируются с образованием

одноцепочечных РНК-интермедиатов.

Эти вирусы инфицируют позвоночных и растения.

Геномы вирусов представлены: частично двухцепочечной незамкнутой ковалентно кольцевой ДНК; кольцевой двухцепочечной ДНК с разрывами в обеих цепях.

Экспрессия геномов этих вирусов сложна и сравнительно слабо изучена.

После этапа раздевания ДНК и вирионная полимераза мигрируют в ядро клетки-хозяина, где ДНК достраивается с помощью ДНК-полимеразы и превращается в сверхспирализованную молекулу. Эта молекула транскрибируется с образованием молекул (+)РНК двух типов - небольших м РНК, кодирующих белки, и полноразмерной геномной РНК, которую затем транскрибирует обратная транскриптаза, синтезируя геномную

ДНК.

Репликация генома включает ряд последовательных процессов. Сначала прегеномная (+)РНК инкапсулируется в сердцевину вириона, содержащую

полимеразу, где фермент, действуя как обратная транскриптаза, синтезирует (-)ДНК. Затем эта цепь ДНК используется как матрица для синтеза (+)цепи ДНК, однако процесс носит незавершенный характер и заканчивается образованием двухцепочечной молекулы ДНК с неполной (+)цепью.

Одновременно с реализацией сложного репликативного цикла вирусная ДНК может интегрироваться в геном клетки.

Достройка неполной цепи вирионной ДНК, синтез прегеномной РНК, обратная транскрипция этой РНК, разрушение РНК-матрицы и синтез неполной второй цепи вирусной ДНК - все эти процессы осуществляются единым вирусным полимеразным комплексом.

Экспрессия генов

Сегментированные вирусные геномы обычно транскрибируются с образованием моноцистронных мРНК. Преимущество таких мРНК заключается в том, что разные белки могут синтезироваться в различных количествах.

При экспрессии несегментированных геномов существует тенденция к продукции полицистронных мРНК. Эти мРНК транслируются с образованием

пол и протеи нов, которые затем расщепляются на зрелые белковые продукты.

Для того чтобы использовать клеточную машинерию, вирусные мРНК на уровне первичной, вторичной или третичной структур должны нести определенные информационные сигналы, которые распознаются клеткой. Сходным образом некоторые ДНК-содержащие вирусы кодируют белки, которые связываются с участком «ориджин» для репликации и стимулируют клеточную ДНК-полимеразу реплицировать именно вирусный геном.

Сборка вирусов и выход их из клетки

Как только вирусные нуклеиновые кислоты и структурные белки синтезированы в достаточном количестве, начинается сборка вирусов. Сборка и выход из клетки зрелых вирусов означает завершение фазы вирусной инфекции (эклипс-фазы), во время которой зрелые вирусы в зараженных клеткам i ю обнаруживаются. Включение нуклеиновых кислот в нуклеокапсиды у всех РНК-содержащих вирусов происходит в цитоплазме, а у всех ДНК-содержащих вирусов - в ядре. Исключение составляют поксвирусы и вирус гепатита В.

У вирусов, капсиды которых имеют форму икосаэдра, капсидные белки способны к самосборке в плотно упакованные и высокоупорядоченные структуры. Затем нуклеиновая кислота (часто нуклеопротеид) проникает в уже сформированный капсид или скручивается вокруг него.

Напротив, при сборке нуклеокапсидов со спиральным типом симметрии, как правило, нуклеиновая кислота служит каркасом, вокруг которого собираются капсидные белки.

На последнем этапе репродукции вирусы должны покинуть зараженную клетку и не связываться вновь с ее поверхностью. Многие вирусы выходят из клетки путем отпочковывания от клеточной мембраны, приобретая при этом внешнюю оболочку. Избыток вирусных поверхностных белков способствует насыщению мембранных рецепторов клетки, препятствуя тем самым повторной адсорбции вируса. У некоторых вирусов поверхностные белки обладают ферментативной активностью и разрушают мембранные рецепторы клетки. Например вирус гриппа синтезирует гликопротеид с нейраминидазной активностью, отщепляющий остаток сиаловой кислоты от гликопротеидов и гликолипидов клеточной мембраны.

Нуклеокапсиды герпесвирусов покрываются внешней оболочкой при отпочковывании от внутренней мембраны ядерной оболочки.

Далее их созревание идет двумя путями:

- вирусы попадают в цитоплазматические пузырьки и после слияния мембраны пузырька с клеточной мембраной выходят во внеклеточное пространство или

- вирусы переходят в цитоплазму, утрачивают внешнюю оболочку и вновь приобретают ее в процессе отпочковывания от клеточной мембраны.

Выход из клетки вирусов, не имеющих внешней оболочки, возможен только при условии гибели клетки и распада ее мембраны.

Методы изучения геномов. Секвенирование

Современные подходы к секвенированию ДНК, их

достоинства и недостатки

Секвенированием называют один из методов расшифровки нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот в молекуле ДНК. Автором этого метода, по праву считают Ф. Сэнгера, который в начале семидесятых годов изобрел первый метод прямого ферментативного секвенирования ДНК.

Существует два основных метода секвенирования; метод Максама-Гилберта (основан на химическом расщеплении ДНК по одному основанию) и метод Сэнгера (дидезокси-метод). Метод Сэнгера более надежен и прост в исполнении, и на практике его используют чаше.

В Оксфордской лаборатории был разработан метод, который позволяет распознавать индивидуальные азотистые основания в нити ДНК. Благодаря этой технологии, по мнению ученых, появилась возможность

создания простого и более дешевого метода секвенирования ДНК.

В основе этой методики лежит разрушение нитей ДНК на индивидуальные нуклеотиды, которые проходят через белок-«нанопору», закрепленную на двойном липидном слое. Помещение пористого белка в солевой раствор и приложение к нему напряжения приводит к протеканию тока через нанопоры, а это, в свою очередь, приводит к тому, что «адаптер» (трубчатая молекула на основе циклодекстрина, встроенная в белок) связывает каждое основание, по мере его прохождения через поры. Во время связывания основания с порами понижается сила тока, при этом для каждого из четырех азотистых оснований наблюдается свойственный только ему уровень уменьшения этого показателя, что и позволяет их различить.

Секвенатор с пористым детектором позволяет считывать ДНК основание за основанием. Причем, отсутствует необходимость в дополнительных операциях, направленных на приготовление образца, обработку и хранение данных.

Команда исследователей из Бостонского Университета (Boston University) предложила новый метод ДНК-секвенирования на кремниевом чипе. Как говорят специалисты, элегантное технологическое решение, которое возможна- благодаря нанотехнологиям, сможет сделать секвенирование генома более быстрым и дешевым.

Профессор биомедицины, Амит Меллер (Amit Meller), в новой работе показал, что с помощью электромагнитных полей можно сделать быструю сортировку фрагментов ДНК.

Приложив между слоев кремния и проводника напряжение, через 4-х нанометровую нанопору перемещаются отрезки ДНК. При этом нужно небольшое количество отрезков ДНК для детектора, что ранее ученые достигали с большим трудом.

Традиционно для секвенирования нужно предварительно изготовить

миллионы копий молекул ДНК, а это очень много для анализа. В текущем исследовании можно обойтись гораздо меньшим количеством.

Кроме успешного метода секвенирования, ученые смогут ближе понять электрофцзику-молекул ДНК и их поведения в наножидкостных системах.

Как говорят исследователи, с помощью секвенатора на нанопоре возможно добиться уменьшения необходимых для секвенирования ДНК-фрагментов до 10000-100000.

Метод Сэнгера

Обычному ныне ферментативному методу секвенирования ДНК с помощью дидезокситерминаторов предшествовал так называемый плюс/минус метод

В его основе также лежало построение второй радиоактивно меченной (за счет присутствия в реакционной смеси одного меченого наряду с тремя немечеными дНТФ) цепи ДНК по существующей матрице с помощью ДНК-полимеразы I (Кленовского фрагмента). В качестве затравки использовался короткий синтетический олигонуклеотидный десятизвенный

праймер. На втором этапе гетерогенные продукты удлинения данного праймера отделяли хроматографией на колонке от ^: непрореагировавших ингредиентов и делились на восемь частей. Четыре части были использованы в минус-системе, где в каждой реакции присутствовало по три разных дНТФ, а четвертый отсутствовал.

Дальнейшее построение цепи новой порцией Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I приводило к удлинению цепи ДНК в каждой реакции до тех пор, пока в матрице не оказывался нуклеотид, комплементарный отсутствующему.

Вторые четыре части с добавлением только одного дНТФ (в каждую - разный) = выдерживались в плюс-системе, где в качестве фермента использовалась З¹—>5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы фага Т4. Так, последовательное отщепление дНМФ-е-Э*» конца ДНК шло до тех пор, пока не встречался дНМФ, дНТФ которого присутствовал в реакционной смеси и тогда в действие вступала уже полимеразная активность Т4 ДНК-полимеразы и фрагмент ДНК приобретал свой окончательный размер.

По завершению всех этих реакций радиоактивно меченные продукты разделялись в полиакриламидном гель- электрофорезе и экспонировались

на рентгеновскую пленку, по которой можно было восстановить нуклеотидную последовательность секвенируемого участка ДНК.

В основе метода секвенирования ДНК, разработанного Сэнгером и соавт., называемого также методом секвенирования путем терминации цепи, лежал принцип ферментативного построения комплементарной цепи ДНК по существующей одноцепочечной матрице при происходящем в разных местах цепи ДНК ингибировании ее дальнейшего роста.

Составляющими секвенирования являлись:

Составляющими секвенирования являлись:

• одноцепочечная матрица ДНК;

• короткая затравочная молекула, комплементарная определенному участку матрицы;

• ДНК-полимераза;

• 2'-дезоксинуклеотид 5'-трифосфаты (ДНТФ);

• 2'3'-дидезоксинуклеотид 5'-трифосфаты (ддНТФ);

• Реакционный буфер с ионами Мg²⁺

Ключевым моментом секвенирования являлась терминация построения

комплементарной цепи ДНК, происходящая при включении ДНК-полимеразой модифицированных аналогов природных субстратов дидезоксинуклеотид трифосфатов, являющихся известными

ингибиторами ДНК-полимеразы. Отсутствие второго гидроксильного остатка в З'-положении рибозного кольца у дидезоксипроизводных приводила к невозможности присоединения к ним следующего нуклеотида, и рост цепи таким образом прерывался.

Терминирование происходило одновременно как бы в двух режимах -заданном и случайном. Заданность определялась тем, что в одной отдельной пробирке наряду со всеми четырьмя дНТФ (один из которых был радиоактивно меченным) присутствовал только один какой-нибудь конкретный ддНТФ, случайность же происходила от того, что включение данного ддНМФ в растущую цепь ДНК было произвольным, но, естественно, с учетом принципа комплементарности. То есть происходила некая конкуренция между дНТФ и ддНТФ при их выборе ДНК полимеразой. Поскольку в четырех реакционных пробирках. (по типу оснований - А, С, G и—Т) присутствовало огромное количество молекул секвенируемой ДНК, во много раз превосходящее ту длину фрагмента, которую могла построить ДНК-полимераза, то по теории вероятности каждое положение этого типа оснований во фрагменте ДНК оказывалось представленным соответствующим ддНМФ.