Биофизика (Присный)

ствие структуры рецептора и структуры сигнальной молекулы, соответствие, фиксированное или индуцируемое. Специфическое понижение свободной энергии происходит вследствие многоточечного взаимодействия, которое и описывается как континуальное соответствие молекулярных поверхностей и находит свое наглядное выражение в атомных моделях. В сущности, старое представление Фишера о соответствии «ключ-замок» и сводится к узнаванию.

Достижение соответствия, как правило, связано с определенной перестройкой взаимодействующих систем и, следовательно, с конформационными превращениями. Реализуются электронно-конформационные взаимодействия – ЭКВ.

Молекулярное кодирование в биологии основывается, в конечном счете, на молекулярном узнавании. Генетический код связан с функционированием ряда узнающих систем. Естественно возникает вопрос о ферментном коде, т. е. о классификации соответствий между активными центрами ферментов и субстратами.

Громадное число комбинаций из 20 видов аминокислотных остатков на поверхности реактивной полости фермента, в его активном центре, обеспечивает практически неограниченное многообразие функциональности ферментов. Можно думать о наличии фиксированных комбинаций, кодирующих узнавание характерных атомных групп субстратов. Точнее, следует говорить о кодовых сорбирующих комбинациях и о кодовых каталитических комбинациях, действующих согласованно, но пространственно разделенных. Имеются некоторые указания на возможность существования такого кода.

Взаимодействие, определяющее узнавание субстрата или ингибитора белком, есть процесс передачи информации молекулярным сигналом рецептору. В большинстве реальных случаев передается не вся информация, содержащаяся в данном объекте, но лишь некоторая ее часть, именуемая сигнатурой. Сигнатурой молекулы служат все те ее особенности, благодаря которым она становится участником данной реакции. В случае образования фермент-субстратного комплекса сигнатурой субстрата являются его функциональные группы, взаимодействующие с активным центром. В свою очередь, сигнатура фермента есть его активный центр, т. е. ограниченная совокупность аминокислотных остатков, непосредственно взаимодействующих с субстратом. Узнавание сводится здесь к структурному соответствию молекулярных сигнатур, реализуемому в результате многоточечных слабых взаимодействий.

Если обратиться к обучаемым узнающим системам, возникающим на более высоких уровнях биологической организации, то станет очевидным, что в результате обучения система должна перестать «обращать внимание» на несущественные обстоятельства. Иными словами, система обучается узнаванию сигнатуры.

Совершенство молекулярного узнавания имеет первостепенное значение для молекулярной биологии и биофизики, в частности, для процессов развития и эволюции.

30

Специфичность ферментов не абсолютна. Данный фермент зачастую катализирует не определенную реакцию одного строго заданного субстрата, а однотипные реакции группы сходных субстратов. Это определяется двумя причинами. Первая непосредственно связана с общей программой онтогенеза

ифилогенеза, приводящей к оптимальной экономии числа действующих белков. В тех ситуациях, в которых биологически существенна одна и та же реакция группы родственных субстратов, она может быть эффективно реализована единственным ферментом. Конечно, вся названная группа должна характеризоваться одной и той же сигнатурой или близкими сигнатурами.

Вторая причина наличия конечного интервала специфичности имеет молекулярно-кинетический характер. Реальная молекулярная узнающая система, фермент, предназначена не только для узнавания сигнала, но и для его достаточно быстрого преобразования. Степень специфичности узнавания выражается свободной энергией взаимодействия. Если выигрыш свободной энергии слишком велик, то прочность фермент-субстратного комплекса может быть настолько большой, что число оборотов фермента окажется чрезмерно низким. Необходимо оптимальное соотношение между стабильностью

искоростью преобразования. Эта ситуация с особенной ясностью проявляется в более простых случаях узнавания в полинуклеотидах и нуклеиновых кислотах.

Характеристики узнавания, определяемые константами стабильности, относятся, конечно, лишь к термодинамическому равновесию. Биологические процессы редупликации ДНК, транскрипции и трансляции – кинетические процессы, идущие с участием соответствующих ферментов. В их основе лежит узнавание ДНК ДНК-полимеразой, лигазами, РНК-полимеразой, узнавание мРНК и тРНК рибосомой.

Межклеточные взаимодействия

Молекулярное узнавание в биологических системах реализуется не только на уровне самих молекул, но и на уровне надмолекулярных клеточных структур.

Межклеточные взаимодействия имеют определяющее значение для существования и развития многоклеточного организма. Взаимодействия эти в высокой степени специфичны в смысле контактов клеток определенного сорта. Они имеют динамический характер – направленные перемещения клеток ответственны за морфогенетическое развитие организма. В результате взаимодействий клеток возникают тканевые структуры.

Можно считать установленным, что межклеточные взаимодействия осуществляются посредством молекулярных, химических сигналов. Это доказывается, в частности, прямыми опытами, в которых взаимодействие клеток нарушалось введением между ними кусочка целлофана. При замене целлофана полосками агара, через который могут проходить более крупные молекулы, взаимодействие восстанавливалось.

Еще в 1907 г. Уилсон показал, что разделенные клетки морской губки объединяются вновь при помещении в морскую воду, причем образуются вполне сформировавшиеся маленькие губки. Позднее было установлено, что

31

такого рода регенерация видоспецифична – из смеси клеток, принадлежавших губкам разных видов, образуются разные виды губок. Сходные явления наблюдаются и у клеток гораздо более сложных организмов.

Очевидно, что такого рода узнавание, приводящее к упорядочению клеток, требует молекулярной сигнализации, контакта и адгезии клеточных поверхностей.

Прямые опыты показывают, что при контакте и взаимодействии клеток происходит резкое увеличение проницаемости клеточных мембран. Наличие межклеточной коммуникации доказывается прохождением малых неорганических ионов (в частности, Са2+) из одной клетки в другую. Установлено также, что сравнительно большие молекулы флуоресцирующих красителей способны переходить из клетки в клетку, если между клетками имеется функциональный контакт.

Образованию контакта предшествует химическая сигнализация между клетками. Сигнализация осуществляется, по-видимому, путем выделения в окружающую среду веществ, являющихся факторами агрегации, узнаваемых клетками. Эти вещества специфичны для сорта ткани, но не для вида. Если поместить в один и тот же сосуд клетки зародыша мыши и зародыша цыпленка, принадлежащие к разным тканям, то образуются раздельные скопления клеток. Если же смешать клетки, взятые у зародышей двух разных видов, но принадлежащие одной и той же ткани, то образуется единое скопление.

В некоторых случаях удалось выделить эти сигнальные вещества. Они представляют собой гликопротеидные частицы, содержащие 47% аминокислот и 49% сахара. Константа седиментации равна 62,55. Частицы имеют вид сфер диаметром 80 нм, снабженных рядом радиальных отростков длиною 110 нм и толщиною 4,5 нм. Таким образом, частица обладает достаточно сложной структурой, функциональность которой пока остается неизвестной.

Перемещение клеток, приводящее к их сортировке, можно объяснять различными способами. Первая гипотеза исходит из представления о хемотаксисе – о миграции клеток определенного типа по направлению к сигнальному веществу, образуемому только клетками этого типа. Вторая гипотеза исходит из предположения о том, что поверхность клетки изменяется под влиянием диспергирующих агентов. Ее изменение приводит к появлению механической активности, клетки приобретают подвижность и беспорядочно движутся в агрегате до тех пор, пока не восстановится прежняя структура их поверхности. При этом возрастает их адгезивность. В таком случае все клетки одного типа будут постепенно накапливаться в кортикальной области агрегата, и оттеснять другие клетки к его середине. Третья гипотеза исходит из дифференциальной адгезивности клеток. Сегрегация обусловлена случайными движениями и количественными различиями в адгезивности клеток. Проблема сводится к рассмотрению термодинамического равновесия в образующейся системе. Экспериментальные данные лучше всего объясняются третьей гипотезой. Однако нельзя считать, что мы располагаем сейчас скольконибудь полной теорией рассматриваемых явлений. Приведенные факты свидетельствуют о специфической химической сигнализации между клетками, о

32

направленных механохимических процессах и о специфических контактных взаимодействиях, определяемых свойствами клеточных мембран. Узнавание на клеточном уровне является сложным процессом и влечет за собой ряд явлений биоэнергетического характера. Сколько-нибудь полную физическую теорию этих явлений пока нельзя построить, так как имеющиеся биохимические сведения для этого недостаточны. Однако предложен ряд моделей, полезных для дальнейшего развития теории.

Вработах предложена теория самосортировки клеток, исходящая из того, что подвижность и дифференцированная адгезивность достаточны для такого процесса. Предполагается, что конечная конфигурация, образуемая клетками, отвечает минимуму свободной энергии их поверхностей. Аналогом такой системы являются капли несмешивающихся жидкостей. Построена двумерная решеточная модель, «клетки» решетки моделируют живые клетки или среду. Вводится величина энергии контакта клеток. Модель, оперирующая изотропными клетками, представляет упорядоченные структуры, не имеющие, однако, биологических аналогов. Напротив, в подобных же модельных системах, содержащих анизотропные клетки, оказывается возможным возникновение аналогов биологических структур.

Спонтанная сегрегация клеток из смешанных агрегатов исследуется на той же основе адгезивности. Рассматривается детализированная модель межмолекулярных взаимодействий, в которой энергия взаимодействия одинаковых клеточных поверхностей отличается от таковой для разных поверхностей. Теория подобна теории разделения несмешиваемых жидкостей.

Вуказанных исследованиях отсутствуют представления о специфической межклеточной сигнализации. Показано, что система клеток, притягивающихся друг к другу посредством хемотаксиса, в ответ на испускаемые ими сигналы может агрегировать. Агрегация инициируется случайными флуктуациями. Если сигнализация кооперативна, то агрегация приводит к характеристическому потоку, подобному наблюдаемому у некоторых миксомицетов. Было проведено детальное экспериментальное исследование агрегации эмбриональных клеток цыпленка. Удалось выделить макромолекулярные факторы, способствующие агрегации, и ввести в них меченые атомы. Оказалось, что эти вещества специфически связываются определенными тканями. На клеточных поверхностях имеются, по-видимому, специфические рецепторы, узнающие факторы, промотирующие агрегацию. Кинетика связывания свидетельствует о его кооперативном характере. Идентификация этих факторов и дальнейшие физико-химические исследования должны привести к выяснению физических основ клеточной агрегации.

Эдельман предложил интересную гипотезу о природе взаимного узнавания клеток, их движения, а также роста тканей, основанную на поверхностной модуляции. Согласно этой гипотезе поверхности клеток данного типа содержат молекулы специфических гликопротеидов. Последние расщепляются определенными протеазами, и остающиеся на поверхностях фрагменты узнают друг друга. Таким образом, состояние поверхности модулируется протеазами, которые, тем самым, управляют адгезией клеток в развивающих-

33

ся тканях. Указанные гликопротеиды являются молекулами, ответственными за ассоциацию клеток. Эдельман отмечает общность разнообразных явлений модуляции поверхности: связи AT-АГ, присоединение вирусов, взаимодействия клеток с гормонами, взаимодействия сперматозоида с яйцеклеткой и т.д. Гипотеза Эдельмана важна и может служить основой для дальнейших исследований.

Отметим, что представление о существенной функции протеаз согласуется с фактами, установленными в совсем иной области биологии. Александров показал, что имеется корреляция между теплоустойчивостью белков ряда организмов и теплолюбивостью этих организмов. Так, ареал травяной лягушки (Rana temporaria) простирается от 43° до 70° с. ш., ареал озерной лягушки (R. ridibunda) – от 40° до 60° с. ш. Температура денатурации ряда белков озерной лягушки на несколько градусов выше, чем травяной. Конечно, эти температуры существенно выше физиологических. Александров убедительно объяснил эти и подобные им эффекты соответствием между генотипически обусловленным уровнем теплоустойчивости белков и средней температурой существования вида. Известно, что протеолиз хорошо коррелирует с денатурацией. Важнейшая роль протеаз, предполагаемая Эдельманом, конкретизирует объяснение фактов, открытых Александровым.

Следует подчеркнуть, что распространенные в литературе представления о том, что специфическое взаимодействие сходных надмолекулярных и клеточных структур определяется специфичностью микроили макроскопических межмолекулярных сил, нельзя считать убедительными. Эти представления вводились вначале для объяснения синапсиса хромосом – один из создателей квантовой механики Иордан считал, что между тождественными участками двух гомологичных хромосом действуют квантовомеханические резонансные силы. В дальнейшем, Джеле рассмотрел специфическое дисперсионное взаимодействие. Однако трудно ожидать существенных различий во взаимодействии структур, построенных из сходных биополимеров, и дисперсионные силы в этих случаях не могут обладать специфичностью.

На уровне организма в целом важнейшее значение имеет химическая сигнализация посредством гормонов, регулирующих поведение ряда систем, образующих организм. Гормоны во многих случаях воздействуют не только на клеточные мембраны, но непосредственно влияют на гены, на ДНК и, тем самым, участвуют в регуляции белкового синтеза. Так, гормон альдостерон регулирует прохождение ионов Na+ и К+ через клеточные мембраны. С помощью радиоактивной метки показано, что альдостерон проникает в клеточное ядро. Через некоторое время после того, как концентрация альдостерона стала внутри клетки максимальной, перемещение ионов через мембрану усиливается. Это происходит вследствие усилившегося синтеза специфического белка. Действительно, если клетки предварительно обработаны антибиотиком пуромицином, то гормон своего действия не оказывает. Между тем известно, что пуромицин блокирует действие генов, препятствует биосинтезу белка.

34

Активность гормонов связана во многих случаях с функционированием важного сигнального вещества живых клеток – циклической АМФ.

Все изложенное подтверждает общие положения современной биологии, согласно которым живой организм следует трактовать как весьма сложную химическую машину. Процессы сигнализации, регуляции, управления в такой машине реализуются посредством молекул на основе молекулярного узнавания.

35

Лекция 5. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БИОПОЛИМЕРОВ

Макромолекула – основная структурная единица живого – включает большое количество атомов и атомных групп. Их тепловое движение, повороты и вращения вокруг единичных связей обусловливают большое число внутримолекулярных степеней свободы, что придает макромолекуле статистические свойства. Одновременно в той же макромолекуле между атомами существуют химические связи, ближние и дальние взаимодействия которых придают вполне определенный детерминистский характер ее конформационным перестройкам. Таким образом, биологическая макромолекула обладает своеобразными свойствами, в основе которых лежит тесное взаимодействие статистических и детерминистских (механических) степеней свободы. В простых химических процессах в растворах продукт реакции появляется вследствие активных соударений молекул реагентов. В отличие от этого результат функционирования макромолекулы в биохимических процессах достигается, прежде всего, вследствие взаимодействия частей единого активного макромолекулярного комплекса. В химии растворов рост температуры вызывает увеличение доли активных кинетических соударений молекул, а в макромолекулярных комплексах этот же фактор может повлиять на их структурную организацию и тем самым на механизм и эффективность внутримолекулярных взаимодействий. Для таких систем, строго говоря, неприменимо понятие химического потенциала как движущей силы процесса, зависящей от исходного числа реагентов. В случае макромолекулярных комплексов реакция определяется не их числом как таковым, а внутримолекулярными взаимодействиями в каждом из них. Это хорошо видно на примере ферментативного катализа.

Основная задача молекулярной биофизики состоит в том, чтобы, исходя из характера взаимодействия атомных групп, определяющих информацию макромолекулы, раскрыть природу ее внутримолекулярной динамики. На этой основе следует перейти к рассмотрению электронных свойств и физических принципов функционирования макромолекул (белков) в биохимических процессах.

Клубок и глобула

Полимерная цепь, где взаимодействуют только соседние звенья, сворачивается в клубок (рис. 1), обладающий большим числом конформаций, переходы между которыми происходят в процессе микроброуновского движения частей цепи. Такой клубок не обладает определенной внутренней структурой, он как бы все время "дышит", причем амплитуда "вздоха" порядка размеров клубка. Взаимное расположение отдельных частей клубка полностью подчиняется статистическим закономерностям. Однако если имеются объемные взаимодействия между атомами, далеко отстоящими друг от друга по цепи, то это существенно меняет всю картину. В реальных макромолекулах объемные взаимодействия элементов цепи создают внутреннее поле, под действием которого образуется глобула с плотной сердцевиной (рис. 2). В отличие от клубка глобула уже обладает определенной пространственной структурой.

36

Рис. 1. Белковый клубок

Сердцевина большой глобулы пространственно однородна с постоянной концентрацией звеньев, большей по сравнению с "опушкой" глобулы. Температурные переходы между состояниями клубка и глобулы одновременно являются переходами между разными фазами и сопровождаются изменениями агрегатного состояния макромолекулы.

В биомакромолекулах наиболее подробно эти процессы изучены в белках. Белковые глобулы претерпевают переходы порядок-беспорядок в относительно малом интервале температуры и напоминают в этом отношений фазовые переходы 1-го рода. В экспериментальных исследованиях на калориметрах к препарату белка обычно подводится тепло с постоянной скоростью и при этом регистрируется скорость повышения температуры белка. Отсюда можно найти теплоемкость белка при различных температурах. Оказывается, что при тепловой денатурации белка и переходах типа порядок-беспорядок происходит одновременно значительное изменение его теплоемкости. Эти изменения не могут быть вызваны только термическим возбуждением внутримолекулярных степеней свободы, а свидетельствуют о структурных перестройках в самой макромолекуле. Детальный характер этих перестроек в белковой глобуле можно понять, зная конкретную природу объемных взаимодействий в белке.

37

Рис. 2. Белковая глобула

Типы объемных взаимодействий

Первичная структура полимерной цепи определяется химическими или валентными взаимодействиями. Объемные взаимодействия в основном определяют вторичную структуру макромолекул. Общим критерием стабильности молекулярной структуры является наличие минимума на кривой зависимости энергии взаимодействия от расстояния между взаимодействующими частями. На малых расстояниях преобладают силы отталкивания, а на больших расстояниях превалирует притяжение. В образовании вторичной структуры белка играют большую роль силы Ван-дер-Ваальса. Они имеют электромагнитную природу и связаны с взаимодействием электрических диполей в соседних молекулах. Наиболее распространены дисперсионные взаимодействия между молекулами, которые не обладают постоянными дипольными моментами. Природа этих сил носит квантовомеханический характер. Движение электрона как квантовой частицы не может быть описано точной механической траекторией, а имеет "размытый" характер. Электрон не может обладать одновременно строго определенными значениями координаты и импульса.

Это значит, что и в основном невозбужденном состоянии существуют быстрые смещения заряда электрона от положения равновесия, а, следовательно, в молекуле в состоянии покоя появляются "мгновенные" дипольные моменты. Появление такого момента в одной молекуле индуцирует появление его в соседней молекуле. Возникает взаимодействие двух быстроменяю-

38

щихся дипольных моментов, которые, таким образом, становятся связанными и притягиваются друг к другу. Энергия притяжения двух мгновенных диполей, или энергия дисперсионного взаимодействия, быстро убывает с расстоянием.

Кроме дисперсионного взаимодействия возможно и электростатическое притяжение между постоянными диполями в полярных молекулах. Кроме того, существуют также индукционные взаимодействия, которые возникают между постоянным дипольным моментом в одной молекуле и наведенным им диполем в соседней поляризуемой молекуле. Суммарное ван-дер- ваальсово взаимодействие двух молекул зависит от вклада всех типов дипольных взаимодействий и составляет по величине от 1,0 до нескольких десятков ккал/моль. Для многих биологических макромолекул глубина энергетического минимума, создаваемого за счет ван-дер-ваальсового притяжения, составляет 1-3 ккал/моль, что по порядку величины сравнимо с величиной тепловой энергии 0,6 ккал/моль молекул при комнатной температуре.

Наряду с силами Ван-дер-Ваальса большую роль в стабилизации биоструктур играют водородные связи и электростатические взаимодействия между заряженными и полярными группами. Водородные связи, например, стабилизируют вторичную структуру полипептидных цепей. В энергию водородной связи дают вклад электростатические взаимодействия, притяжение и отталкивание, а также энергия делокализации электронов. Величины энергии водородной связи сильно варьируют (3-8 ккал/моль).

Внутреннее вращение и поворотная изомерия имеют важное значение в конформационной структуре макромолекулы. Энергия ближних взаимодействий атомных групп зависит от расстояний между ними, которые в свою очередь меняются при вращении этих групп вокруг единичных связей. При близком расположении валентно не связанные атомы начинают отталкиваться, и возникает тормозящий энергетический потенциал, препятствующий вращению атомных групп. Энергия вращения атомных групп вокруг единичных связей дает основной вклад в общую конформационную энергию полимерной цепи. Общая конформационная энергия полимера зависит от взаимных углов поворотов звеньев вокруг единичных связей. Подобная система, где энергия составляющих элементов зависит от их взаимодействия друг с другом, называется кооперативной.

Конформационная энергия полипептидной цепи определяется всеми видами объемных взаимодействий и зависит от энергии внутреннего вращения боковых цепей аминокислотных остатков вокруг единичных связей.

В этом случае взаимное влияние звеньев при изменении их положения может передаваться вдоль цепи через большое число связей, и тогда вклад их в общую конформационную энергию трудно учесть. Однако на самом деле двойной характер пептидной связи препятствует вращению вокруг нее. Он обусловлен обобществлением неподеленной пары 2 S электронов атома азота между азотом и углеродом. Вследствие этого происходят выталкивание электрона углерода из двойной n-связи С=О и локализация его на кислороде с частичным превращением связи С=О в одиночную.

39