Биофизика (Присный)

стности зависимость многих физиологических функций мембран и активности отдельных мембранных ферментов от фазового состояния липидов в мембране, ее текучести (вязкость). Более поздняя белково-кристаллическая модель (G. Vanderkooi, D. Green, 1970) отличается от жидкомозаичной модели фактически лишь постулированием существовании в мембране жесткой белковой структуры, возникающей в результате дальнодействующих белок-белковых связей.

Внастоящее время получили наибольшее распространение различные варианты жидкомозаичной модели.

Характер взаимодействия полярных и неполярных групп белка и липидного бислоя приводит к тому, что пептид должен быть расположен так, чтобы максимально возможное количество неполярных аминокислотных остатков было погружено в бислой. Это очевидное требование определяет характер трех основных типов белок-мембранных комплексов, которые включают β- складчатые и α-спиральные структуры с различным соотношением полярных и неполярных групп. Предполагается, что амфифильные (β-складчатые структуры (тип 1)) сворачиваются с образованием пор для пассивной диффузии веществ через мембраны. Внутри такой поры расположены полярные, а наружи в контакте с бислоем – неполярные группы.

Пептидные гормоны могут образовывать комплексы (тип 2) с мембранами. Структуры типа 3 характерны для интегральных мембранных белков, пронизывающих мембраны своими α-спиралями.

Вцелом, биологическую мембрану можно рассматривать как электрический конденсатор, в котором пластинами являются электролиты внеклеточного раствора и цитоплазмы с погруженными в них головками липидных молекул. Проводники разделены диэлектрическим слоем, образованным неполярной частью липидных молекул – двойным слоем их хвостов. Липиды – диэлектрики с диэлектрической проницаемостью ε ≈ 2.

Емкость плоского конденсатора –

с =		0 S	, где ε0 – электрическая постоянная = 8,85∙10	12	Ф/м, d – рас-
	d

стояние между пластинами конденсатора, S – площадь пластины. Удельная емкость (на единицу площади) –

суд = 0 .

d

Отсюда можно найти расстояние между пластинами конденсатора, соответствующее толщине липидной части мембраны –

	d =	0		8,85 1012 2	3,5 нм.
		Суд		0,5 10 2

Важную роль в выяснении морфологии мембран сыграли два метода: дифракция рентгеновских лучей и электронная микроскопия.

Дифракция рентгеновских лучей. При исследовании высокоупорядоченных кристаллических образцов с помощью метода дифракции рентгеновских лучей удаётся получить информацию о структуре с высоким разреше-

50

нием. В случае же малоупорядоченных препаратов возможности этого метода ограничены. Некоторые специализированные мембранные системы уже имеют регулярную структуру, и поэтому их можно изучать рентгеноструктурными методами. Примером такого рода служит миелиновая оболочка периферических нервных волокон; она представляет собой мембрану, которая, многократно оборачиваясь вокруг аксона, формирует регулярную систему из концентрических мембранных структур. Исследования дифракции рентгеновских лучей на миелине подтверждают адекватность бислойной модели мембран. Полученные данные показывают, что структура всех мембран сходна: они имеют гидрофобную внутреннюю область с низкой электронной плотностью и два слоя полярных группировок с высокой электронной плотностью.

Электронная микроскопия. Информацию о расположении мембранных белков дают методы замораживания-скалывания и замораживаниятравления. Последовательность действий такова. 1. Замораживание образца. 2. Скалывание с помощью ножа при низкой (- 1000С) температуре в глубоком вакууме. Возникающие при скалывании усилия приводят к образованию среза, проходящего через образец. Когда плоскость среза проходит через мембрану, она раскалывается преимущественно по своей срединной области и расщепляется на две половинки. В результате на образовавшихся плоскостях скола обнажается внутренняя область мембраны. 3. При необходимости образец подвергают травлению – проводят обычную возгонку льда в вакууме. Это позволяет лучше визуализировать поверхностные структуры клеточных мембран. 4. После этого получают так называемую реплику с обнаженной поверхности. Именно эту реплику и изучают под электронным микроскопом.

Результаты показали, что не все липиды в мембране расположены по принципу бислоя. Физические методы исследования показывают, что липидная фаза мембран содержит участки, где липидные молекулы не образуют двойной слой.

Основная область приложения биофизики – структурная основа мембраны, а именно двойной слой фосфолипидных молекул.

Динамика мембран

Режим функционирования мембраны в значительной степени зависит от микровязкости липидного бислоя и подвижности фосфолипидных молекул в мембране, фазового состояния мембранных липидов. Отклонения биофизических характеристик липидного бислоя от нормы связано с разного рода патологиями. Важную роль в физиологии клетки играют фазовые переходы в биологических мембранах.

Липидная фаза биологических мембран при физиологических условиях (температуре, давлении, химическом составе окружающей среды) находится в жидком агрегатном состоянии. Это доказано тремя биофизическими методами.

Флуоресцентный анализ. В нормальном состоянии мембрана не флуоресцирует. Чтобы провести исследования мембраны флуоресцентным методом, надо вводить в мембрану молекулы или молекулярные группы, способ-

51

ные к флуоресценции. В качестве флуоресцентных зондов используются: ДМХ – диметиламинохалкон; МБА – 3-метоксибензантрон; АНС – 1-анилин- нафталин-сульфонат. Флуоресцентный анализ дает возможность исследовать подвижность фосфолипидных молекул в мембране, оценить вязкость липидной фазы (т.н. микровязкость мембран). Это можно оценить по изменениям спектров флуоресценции, а также по степени поляризации флуоресцентного излучения при освещении мембраны поляризованным светом. Степень связи поляризации и микровязкости мембраны выражается формулой Перрена-

Яблонского –	1		1		(	1		1	)(1	RT	) , где P0 – степень поляризации света на
						P0
	P 3						3			V

неподвижных молекулах; R – универсальная газовая постоянная = 8,31 Дж/(К·моль); Т [K] – температура; V – молярный объем флуоресцирующих молекул; η – микровязкость мембраны; τ – время жизни возбужденного состояния.

Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР). Это явление резкого воз-

растания поглощения энергии электромагнитной волны системой парамагнитных частиц (электронов с некомпенсированными спинами), помещенных

во внешнее магнитное поле при резонансной частоте волны νрез: νрез = g B , h

где В – индукция магнитного поля, h – постоянная Планка (6,626176·10-34 Дж·с), g – гидромагнитное отношение, или g-фактор, зависящий от природы парамагнитных частиц (для свободного электрона g ≈ 2), β – магнетон Бора (0,927 · 1023 Дж/Тл). Практически удобнее оставлять частоту электромагнитной волны постоянной, а медленно менять индукцию магнитного поля. Резо-

нансное поглощение энергии будет наблюдаться при Врез = h . В ЭПР ис- g

пользуются частоты электромагнитного поля ν~1010 Гц и индукция В~0,3 Тл. Спектром ЭПР называется зависимость мощности поглощения электромагнитной волны от величины магнитной индукции. Чем сильнее взаимодействие между атомами и молекулами образца, тем шире спектры ЭПР. Соответственно, чем слабее взаимодействие между частицами (т.е. подвижность молекул выше), тем спектры ЭПР уже. Так как молекулы фосфолипидов диамагнитны, для ЭПР-исследований биомембран используются спин-зонды и спин-метки – молекулы или молекулярные группы с неспаренными электронами. Парамагнитные спин-зонды вводятся в липидную мембрану, спектры поглощения спин-зондами электромагнитной волны дают информацию о свойствах липидного окружения, в частности о подвижности липидных молекул в мембране. Недостаток метода – внесение в биологический объект чужеродных молекул-зондов может изменять структуру объекта.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Это явление резкого возрастания поглощения энергии электромагнитной волны системой атомных ядер, обладающих магнитным моментом, помещенных во внешнее магнитное поле,

при резонансной частоте волны – νрез = gя · я В , где gя – ядерный множи- h

тель Ландье, имеющий разные значения для разных парамагнитных ядер (для

52

протона = 5,58); μя – ядерный магнетон (составляет 1/1836 часть магнетона Бора).

Магнитным моментом обладают, например, такие ядра, как 11Н , 136 С , 1531Р . Не обладают магнитным моментом 24Не , 168 О , 126 С . В биологических объектах содержится много протонов (11Н ), что дает возможность применять для их исследования ЯМР. В ЯМР используются более сильные магнитные поля (В ≈ 1 Тл), а частоты переменного электромагнитного поля меньше (5·107 Гц) чем в ЭПР.

Биофизические исследования показали, что подвижность фосфолипидных молекул в мембране сравнительно велика, а вязкость мала. В нормальных физиологических условиях липидная часть мембраны находится в жидком агрегатном состоянии.

Изменение микровязкости липидного окружения мембранных белковферментов резко сказывается на их функционировании. Некоторые экспериментальные данные свидетельствуют о том, что значительное снижение вязкости липидной фазы мембраны обусловливает канцерогенез. При старении вязкость увеличивается.

Высокая подвижность липидных молекул обусловливает латеральную (боковую) диффузию. Это хаотическое перемещение молекул липидов и белков в плоскости мембраны. При латеральной диффузии рядом расположенные молекулы липидов скачком меняются местами и т.о. молекула перемещается вдоль поверхности мембраны. Среднее квадратическое перемещение молекул при диффузии за время t можно оценить по формуле Эйнштейна Sкв=2 D t , где D – коэффициент латеральной диффузии.

Перемещение молекул по поверхности мембраны клетки за время t определено экспериментальным методом флуоресцентных меток. Оказалось, что среднее квадратичное перемещение за секунду фосфолипидной молекулы по поверхности мембраны эритроцита составило около 5 мкм, что сравнимо с размерами клеток, т.е. за секунду молекула может обежать всю поверхность небольшой клетки. Для белковых молекул Sкв составляет около 0,2 мкм/с.

Рассчитанные по формуле Эйнштейна коэффициенты латеральной диффузии Dлип = 6 · 10-12 м2/с, Dб = 10-14 м2/с.

Частота перескоков молекулы вследствие латеральной диффузии мо-

жет быть найдена по формуле ν = 2 3 D , где f – площадь, занимаемая одной

f

молекулой в мембране.

Для молекул фосфолипидов f ≈ 7 · 10-19 м2, ν = 3 · 107 с-1. Каждая молекула, т.о., в среднем претерпевает десятки миллионов перестановок в плос-

кости мембраны за секунду, т.е. характерное время одного перескока τ =10-7- 10-8 с.

Флип-флоп – диффузия молекул мембранных фосфолипидов поперек мембраны. Скорость перескоков молекул с одной поверхности мембраны на другую определена методом спиновых меток на модельных липидных мем-

53

бранах – липосомах. Установлено, что половина меченых молекул претерпевает флип-флоп примерно за 6,5 часов. Таким образом, флип-флоп совершается значительно медленнее, чем перескоки при латеральной диффузии. Благодаря затрудненному переходу поперек мембраны поддерживается упорядоченность в молекулярной структуре мембраны, а также асимметрия расположения липидных и белковых молекул и определенная ориентация белковферментов поперек мембраны.

Физическое состояние и фазовые переходы липидов в мембранах

Липидные бислойные мембраны при физиологических условиях – жидкие, время оседлой жизни фосфолипидных молекул в мембране мало – 10-7-10-8 с. Вместе с тем, молекулы в мембране размещены не беспорядочно,

вих расположении наблюдается дальний порядок. Фосфолипидные молекулы находятся в двойном слое, а их гидрофобные хвосты приблизительно параллельны друг другу. Есть порядок и в ориентации полярных гидрофильных голов.

Физическое состояние, при котором есть дальний порядок во взаимной ориентации и расположении молекул, но агрегатное состояние жидкое, называется жидкокристаллическим состоянием. Жидкие кристаллы могут образовываться не во всех веществах, а в веществах из длинных молекул (поперечные размеры которых меньше продольных). Жидкокристаллические структуры могут быть:

1)Нематическая (нитевидная) – длинные молекулы ориентированы параллельно друг другу;

2)Смектическая (мылообразная) – молекулы параллельны друг другу и располагаются слоями;

3)Холестерическая – молекулы располагаются параллельно друг другу

водной плоскости, но в разных плоскостях ориентации молекул разные.

Бислойная липидная фаза биологических мембран соответствует смектическому жидкокристаллическому состоянию.

Жидкокристаллические структуры очень чувствительны к изменению температуры, давления, химического состава, электрическому полю. Это определяет изменение структуры липидных бислойных мембран при различных изменениях внешних условий или химического состава. При определенных температурах происходит фазовый переход первого рода. В частности, при понижении температуры в фосфолипидной мембране происходит переход из жидкокристаллического в гель-состояние, которое условно иногда называют твердокристаллическим. В гель-состоянии молекулы расположены еще более упорядочено. Все гидрофобные хвосты фосфолипидных молекул в гель-фазе полностью вытянуты строго параллельно друг другу. Поэтому толщина мембраны в гель-фазе больше, чем в жидком кристалле.

Однако при переходе из твердого в жидкокристаллическое состояние несколько увеличивается объем, так как возрастает площадь мембраны, приходящаяся на одну молекулу. Поскольку в твердокристаллическом состоянии больше порядок, чем в жидком кристалле, ему соответствует меньшая энтропия.

54

Для нормального функционирования мембрана должна быть в жидкокристаллическом состоянии. Поэтому в живых системах при продолжительном понижении температуры окружающей среды наблюдается адаптационное изменение химического состава мембран, обеспечивающее понижение температуры фазового перехода. Температура фазового перехода понижается при увеличении числа ненасыщенных связей в жирнокислотных хвостах. В хвосте молекулы может быть до четырех ненасыщенных связей. В зависимости от химического состава липидных мембран температура фазового перехода гель – жидкий кристалл меняться от -20 (для мембран из ненасыщенных липидов) до +600С (для насыщенных липидов).

Модельные липидные мембраны

Липосомы (фосфолипидные везикулы) получают обычно при набухании сухих фосфолипидов в воде или при впрыскивании раствора липидов в воду. При этом происходит самосборка бимолекулярной липидной мембраны. При этом все неполярные гидрофобные хвосты находятся внутри мембраны, и ни один из них не соприкасается с полярными молекулами воды. Чаще получаются несферические липосомы, состоящие из нескольких бимолекулярных слоёв – многослойные липосомы. Отдельные бимолекулярные слои многослойной липосомы отделены водной средой. Однослойные липосомы можно получить из суспензии многослойных липосом, если обработать их ультразвуком. Липосомы представляют собой в некотором роде прообраз клетки. Они служат моделью для исследований различных свойств клеточных мембран и используются в медицине.

Плоские бислойные липидные мембраны – другой тип модельных мембран. Такие мембраны получают на маленьких отверстиях диаметром около 1 мм в пластине из фторопласта, погруженной в водную среду. На отверстие наносят каплю раствора липидов (в спирте, хлороформе, гептане). Растворитель диффундирует из раствора в воду, и на отверстии остается пленка липида. Эта пленка спонтанно утончается до тех пор, пока не образуется бимолекулярный слой толщиной около 6 нм. Лишний липид собирается в виде ободка у краев отверстия.

55

Пассивный транспорт

Лекция 7. ТРАНСПОРТ ВЕЩЕСТВ ЧЕРЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ

Живые системы на всех уровнях организации – открытые системы. Поэтому транспорт веществ через биологические мембраны – необходимое условие жизни. С переносом веществ через мембраны связаны процессы метаболизма клетки, биоэнергетические процессы, образование биопотенциалов, генерация нервного импульса и др.

Большое значение для описания транспорта веществ имеет понятие электрохимического потенциала. Химическим потенциалом данного вещества называется величина, численно равная энергии Гиббса, приходящаяся на один моль этого вещества. Для разбавленного раствора с концентрацией вещества С:

μ = μ0 + RTlnC,

где μ0 – стандартный химический потенциал, численно равный химическому потенциалу данного вещества при его концентрации 1 моль/л в растворе.

Электрохимический потенциал – величина, численно равная энергии Гиббса на один моль данного вещества, помещенного в электрическом поле.

Для разбавленных растворов:

= μ0 + RTlnC + ZFφ,

где F = 96500 Кл/моль – число Фарадея, Z – заряд иона электролита (в элементарных единицах заряда), φ – потенциал электрического поля, Т [К] – температура.

Пассивный перенос веществ через мембрану

– это перенос вещества из мест с большим значением электрохимического потенциала к местам с его меньшим значением. Пассивный транспорт идет с уменьшением энергии Гиббса, и поэтому этот процесс может идти самопроизвольно без затраты энергии. Плотность потока вещества при пассивном транспорте подчиняется уравнению Теорелла:

jm = - UC ∙ d , dx

где U – подвижность частиц, С – концентрация, частное – градиент электрохимического потенциала. Знак минус показывает, что перенос происходит в сторону убывания .

Плотность потока вещества – это величина, численно равная количеству вещества, перенесенного за единицу времени через единицу площади поверхности, перпендикулярной направлению переноса:

jm = m (моль/м2∙с)

S t

Подставив в уравнение Теорелла выражение для электрохимического потенциала, получим для разбавленных растворов при μ0 = const уравнение Нернста-Планка:

jm = - URT dC -UCZF d . dx dx

56

В целом, могут быть две причины переноса вещества при пассивном

транспорте: градиент концентрации dC и градиент электрического потен- dx

циала d . dx

Знаки минусов перед градиентами показывают, что градиент концентрации вызывает перенос вещества от мест с большей концентрацией к местам с его меньшей концентрацией; а градиент электрического потенциала вызывает перенос положительных зарядов от мест с большим к местам с меньшим потенциалом.

Вотдельных случаях вследствие сопряжения этих двух причин может происходить пассивный перенос вещества от мест с меньшей концентрацией

кместам с большей концентрацией, если второй член уравнения НернстаПланка по модулю больше первого, и может происходить перенос вещества от мест с меньшим потенциалом к местам с большим потенциалом, если первый член уравнения по модулю больше второго.

Вслучае неэлектролитов (Z = 0) или отсутствия электрического поля

( d ) уравнение Теорелла переходит в уравнение: jm = - URT dC .
dx	dx

Согласно соотношению Эйнштейна коэффициент диффузии D = URT. В результате получаем уравнение, описывающее простую диффузию – закон Фика:

jm = - D dC dx

Диффузия – самопроизвольное перемещение вещества из мест с большей концентрацией в места с меньшей концентрацией вещества вследствие хаотического теплового движения молекул.

Диффузия вещества через липидный бислой вызывается градиентом концентрации в мембране. Плотность потока вещества по закону Фика

	Сь Сь
jm = - D	2 1	, где С – концентрации вещества в мембране около одной
	l

ее поверхности и около другой, l - толщина мембраны.

Так как измерить концентрации C трудно, на практике пользуются формулой, связывающей плотность потока вещества через мембрану с концентрациями этого вещества не внутри мембраны, а снаружи в растворах около поверхностей мембраны, С1 и С2:

jm = P(C1 - C2),

где Р – коэффициент проницаемости мембраны. Так как плотность потока вещества j имеет размерность моль/м2∙с, концентрация С – моль/м3, размерность коэффициента проницаемости Р – м/с.

Коэффициент проницаемости мембраны зависит от свойств мембраны и переносимых веществ. Если считать концентрации вещества у поверхности в мембране прямо пропорциональными концентрациям у поверхности вне мембраны, то С1м = КС1, С 2м = КС2. Величина К носит название коэффициента

57

распределения, который показывает соотношение концентрации вещества вне мембраны и внутри ее, т.е. получается

jm =	DK	(С1	– С2) → Р =	DK	.
	l			l

Коэффициент проницаемости тем больше, чем больше коэффициент диффузии (чем меньше вязкость мембраны), чем тоньше мембрана и чем лучше вещество растворяется в мембране (чем больше К).

Хорошо растворимы в фосфолипидной фазе мембраны неполярные вещества, например органические жирные кислоты, эфиры. Этим вещества хорошо проникают через липидную фазу мембраны. Плохо проходят через липидный бислой полярные, водорастворимые вещества: соли, основания, сахара, аминокислоты, спирты.

Через липидные и белковые поры сквозь мембрану проникают молекулы нерастворимых в липидах веществ и водорастворимые гидратированные ионы (окруженные молекулами воды). Для жиронерастворимых веществ и ионов мембрана выступает как молекулярное сито: чем больше размер молекулы, тем меньше проницаемость мембраны для этого вещества.

В биологических мембранах существует облегченная диффузия. Облегченная диффузия происходит при участии молекул переносчиков. Например, валиномицин – переносчик ионов калия.

Облегченная диффузия происходит от мест с большей концентрацией переносимого вещества к местам с меньшей концентрацией. По-видимому, облегченной диффузией объясняется также перенос через биологические мембраны аминокислот, сахаров и других биологически важных веществ.

Отличия облегченной диффузии от простой:

1)перенос вещества с участием переносчика происходит значительно

быстрее;

2)облегченная диффузия обладает свойством насыщения: при увеличении концентрации с одной стороны мембраны плотность потока вещества возрастает лишь до некоторого предела, когда все молекулы переносчика уже заняты;

3)при облегченной диффузии наблюдается конкуренция переносимых веществ в тех случаях, когда переносчиком переносятся разные вещества; при этом одни вещества переносятся лучше, чем другие, и добавление одних веществ затрудняет транспорт других; так, из сахаров глюкоза переносится лучше, чем фруктоза, фруктоза лучше, чем ксилоза, а ксилоза лучше, чем арабиноза, и т.д.;

4)есть вещества, блокирующие облегченную диффузию – они образуют прочный комплекс с молекулами переносчика, например, флоридзин подавляет транспорт сахаров через биологическую мембрану.

Разновидностью облегченной диффузии является транспорт с помощью неподвижных молекул-переносчиков, фиксированных определенным образом поперек мембраны. При этом молекула переносимого вещества передается от одной молекулы переносчика к другой, как по эстафете.

58

Фильтрация – это движение раствора через поры в мембране под действием градиента давления. Скорость переноса при фильтрации подчиняется закону Пуазейля:

dV P1 P2 , dt W

	где	dV	-	объемная скорость переноса раствора, W – гидравлическое
		dt			8 l
	сопротивление:			W =		, l – длина поры, r – радиус, η – коэффициент вяз-
					r4

кости раствора.

Явление фильтрации играет важную роль в процессах переноса воды через стенки кровеносных сосудов.

Осмос – преимущественное движение молекул воды через полупроницаемые мембраны (непроницаемые для растворенного вещества и проницаемые для воды) из мест с меньшей концентрацией растворенного вещества в места с большей концентрацией. Осмос – по сути дела, простая диффузия воды из мест с ее большей концентрацией в места с меньшей концентрацией воды. Осмос играет большую роль во многих биологических явлениях. Явление осмоса обусловливает гемолиз эритроцитов в гипотонических растворах.

Активный транспорт веществ

Активный транспорт – это перенос вещества из мест с меньшим значением электрохимического потенциала в места с его большим значением.

Активный транспорт в мембране сопровождается ростом энергии Гиббса, он не может идти самопроизвольно, а только в сопряжении с процессом гидролиза аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), то есть за счет затраты энергии, запасенной в макроэргических связях АТФ.

За счет активного транспорта в организме создаются градиенты концентраций, градиенты электрических потенциалов, градиенты давления и т.д., поддерживающие жизненные процессы, то есть с точки зрения термодинамики активный перенос удерживает организм в неравновесном состоянии, поддерживает жизнь.

Существование активного транспорта веществ через биологические мембраны впервые было доказано в опытах Уссинга (1949 г.) на примере переноса ионов натрия через кожу лягушки. Экспериментальная камера Уссинга, заполненная нормальным раствором Рингера, была разделена на две части свежеизолированной кожей лягушки. Наблюдались потоки ионов натрия через кожу лягушки: слева направо от наружной к внутренней поверхности и справа налево от внутренней к наружной поверхности.

Из уравнения Теорелла, описывающего пассивный транспорт, следует уравнение Уссинга-Теорелла для отношения этих потоков в случае пассивного транспорта:

	jm,вн		Снар	∙ e	ZF
		=				.
					RT
	jm,нар
			Свн

На коже лягушки, разделяющей раствор Рингера, возникает разность потенциалов – внутренняя сторона кожи имеет положительный потенциал по

59