КНОРРЕ_3227

230 Глава 10. Химический синтез пептидов и белков

Вое -N H —(рН-СООН	Вое—NH— <рН-СООН

Я	o 2n

// N0:2

o 2n

По завершении пептидного синтеза динитрофенильную защиту можно удалить действием сильного нуклеофила, например, тиола.

-v*~NH-(pH-CO-^

Для защиты гистидина часто используют тозильную (Tos) защиту. Ее можно ввести путем взаимодействия Z-гистидина с и-толуолсульфохлоридом (30 мин при -10 °С; затем 4 ч при комнатной температуре).

Z-N H -ГН -П П О Н

Z -N H -C H -C O O H

+

Вг H ,N -CH -CO O H

НВг/АсОН I

гн

Защитная группа А^'-тозилгистидина устойчива к каталитическому гид­ рированию, к действию трифторуксусной кислоты или бромистого водорода. Ее можно удалить 1 н раствором NaOH (1 ч, 20 °С), безводным фтористым водородом (30 мин, 0 °С), натрием в жидком аммиаке. В последнем случае для удаления тозильной группы защищенную аминокислоту или пептид рас­ творяют в жидком аммиаке и к этому раствору медленно добавляют натрий. По окончании реакции избыток натрия связывают, добавляя хлорид аммония, йодид аммония или уксусную кислоту. Защищенный пептид может деблоки­ роваться ангидридами карбоновых кислот в пиридине (3,5 ч, комнатная тем-

§10.7. Блокирование боковых групп в аминокислотах

231

пература), а также в присутствии широко применяемого в пептидном синтезе l-jV-гидроксибензотриазола (1 ч, комнатная температура). При таком типе защит не следует использовать карбодиимидный способ активации карбок­ сильной группы в присутствии нуклеофильного катализатора, так как дебло­ кированный остаток гистидина может реагировать с образующимся в про­ цессе активации N-гидроксибензотриазолиевым производным. Образующий­ ся ацилимидазолид является ацилирующим агентом, поэтому появляется серьезный риск получения пептидов с незапланированной структурой.

Ы'ш-(яг)-бензилоксиметильная (Вот) и N'm-(я)-/ире/«-бутилоксиметильная (Вит) группы оказались в наибольшей мере удовлетворяющими всем требо­ ваниям, предъявляемым к защитным группам, используемым в пептидном синтезе, так как получающиеся производные устойчивы к рацемизации, дей­ ствию нуклеофилов и щелочей. Вое-His(я-Вот)-0Н и £oc-His(тг-Вит)-ОН синтезируют обработкой Boc-His(r-Boc)-OMe бензилхлорметиловым или тре/и-бутилхлорметиловым эфиром соответственно с последующим удале­ нием 2?ос-защиты с остатка гистидина и омылением метилового эфира. В от­ личие от Вос-защиты, на а-аминогруппе производное His(5oc) неустойчиво в присутствии щелочей.

H.N-CH-COOH		Boc-NH-CH-COOH
гI.н	Вос20	I

N ^ N -B o c

Boc-NH-CH-COOH

NaOH / MeOH - H20

N ^N -C H ^O -C H ^Ph

У -(л)-отре/и-бутилоксиметильная группа достаточно легко удаляется об­ работкой трифторуксусной кислотой. //'"-(л)-бензилоксиметильная группа может быть удалена только при действии очень сильной кислоты (жидкого фтористого водорода) или каталитическим гидрогенолизом.

Введение в полипептидную цепь остатков глутамина и аспарагина карбодиимидным методом сопровождается иногда побочной реакцией дегидрата­ ции амидной группы. Однако если при этом добавить эквимольное количест­ во 1-TV-гидроксибензотриазола или использовать активированные эфиры глу­ тамина или аспарагина, то указанный нежелательный процесс не идет. Дру­ гим способом подавления этой побочной реакции является использование для синтеза аспарагинили глутаминсодержащих пептидов мономеров с бло­

232 Глава 10. Химический синтез пептидов и белков

кированными амидными группами. Следует подчеркнуть, что при этом улучшается растворимость пептидов в органических растворителях.

Наиболее употребительными из защитных групп являются: 4,4- диметоксибензгидрильная (МЬН), 9-ксантильная (Хап\ 2,4,6-триметокси- бензильная (ТтоЬ) и тритильная (Trt).

4,4 ’-Диметоксибензгидрильную (МЬН) защиту вводят через взаимодейст­ вие 4,4’-диметоксибензгидрилового спирта с карбобензокси-Ь-глутамином или карбобензокси-Ь-аспарагином в концентрированной серной кислоте

в течение 12 часов при комнатной температуре:
		о-сНз	9 00Н
Z - N H — С Н -С О О Н		н	Z - N H — СН
		-н2о
(С1Н2)2	+
| 22		но-сн

о=с

I

NH,

0-сн3

9-Ксантшьную (Хап) и тритилъную (Trt) группы вводят аналогично

МЬН-защите, используя 9-ксантиловый и тритиловый спирт соответственно.

Fmoc—NH—CH—СООН

СН,

-Н20

о=сI 2

n h 2

2,4,6-Триметоксибензильную (ТтоЬ) защитную группу вводят карбодиимидным методом в присутствии 1-УУ-гидроксибензотриазола или TV-гидрокси- сукцинимида, используя 2,4,6-триметоксибензиламин и защищенные по С-концу Asn или Gin.

Все четыре защитные группы устойчивы в присутствии оснований и де­ блокируются в кислых условиях. 4,4’-Диметоксибензгидрильная группа лег­ ко удаляется смесью трифторуксусной кислоты с анизолом (10:1) при нагре­ вании (5 мин) или при комнатной температуре (22 °С, 2-3 ч). Остальные группы еще более лабильны в присутствии кислоты.

§ 10.7. Блокирование боковых групп в аминокислотах

233

В качестве группы для защиты индолъного гетероцикла в триптофане используется формильная группа. Для введения этой группы через раствор триптофана в муравьиной кислоте пропускают ток сухого НС!:

H 2N— СН— СООН	h 2n — сн—СООН
HCI / н с о о н
--------------------

В отличие от триптофана, образующийся А^-^огт-триптофан не флуо­ ресцирует в ультрафиолете и не дает фиолетовой окраски с реактивом Эрли­ ха (и-диазобензолсульфокислота). Это можно использовать для наблюдения за протеканием процесса. От триптофансодержащих пептидов Нефор­ мальная группа легко отщепляется при обработке соответствующих соеди­ нений 0,1 М раствором пиперидина или триэтиламина в воде в течение 10 мин при температуре 0 °С с последующей лиофилизацией.

Поскольку индольное кольцо в кислой среде весьма склонно к окисле­ нию, при удалении защитных групп триптофансодержащих пептидов трифторуксусной кислотой добавляют в реакционную смесь 2 % меркаптоэтанола или дитиотреита. При использовании для удаления Вое-защиты безводного фтористого водорода наблюдается mpem-бутилирование триптофана:

Для защиты индольного кольца от этой побочной реакции необходимо добавлять тиоанизол, диметилсульфид или другие нуклеофильные реагенты. Разрушение триптофана не идет при деблокировании каталитическим гидрогенированием или при обработке триптофансодержащих пептидов концен­ трированной муравьиной кислотой.

Синтез метионинсодержащих пептидов можно проводить без специаль­ ной защиты тиоэфирной группы метионина. Однако замечено, что при де­ блокировании Z-группы метионинсодержащих пептидов бромистым водоро­

234	Глава 10. Химический синтез пептидов и белков

дом в уксусной кислоте может происходить расщепление тиоэфирной связи с образованием 5-бензилгомоцистеина.

Чтобы избежать этой побочной реакции, предложено использовать сульфоксидную (CH3S—>0) защиту. Метионинсульфоксид легко получается при окислении метионина (или соответствующих его производных) 30 % переки­ сью водорода в соляной или уксусной кислоте (60 мин, комнатная темпера­ тура):

H,N—СН— СООН		Н20 2	H.N—СН— СООН
2	I		2	|
	(СН2)2	----------►		(СН2)2
	s -ch3	АсОН	о-*- s -ch3

Остаток метионинсульфоксида в синтезированном пептиде легко восста­ навливается до метионина в присутствии тиогликолевой кислоты, p-меркаптоэтанола, водородом над палладиевым катализатором, никелем Ренея, натрием в аммиаке и др. Лучше всего проводить восстановление тиог­ ликолевой кислотой (меркаптоуксусная кислота, 20 ч в атмосфере азота, 50 °С).

Поскольку тиольная группа является сильным нуклеофилом, при пептид­ ном синтезе необходима защита SH-группы. Одной из широко применяемых защитных групп является 5-бензильная группа. Защиту вводят обработкой цистеина бензилхлоридом:

С! NH3—СН— СООН	Ph-CH2CI	H2N—СН— СООН
I		I ,
СН2	-------- i* .	СН2
SH	ОН	S-CH2-Ph

Бензильные группы чувствительны к гидрогенолизу, и поэтому деблоки­ рование можно проводить с помощью натрия в жидком аммиаке. Менее же­ лательно использовать каталитическое гидрирование, так как катализатор будет отравляться серосодержащим соединением.

Эта защита гладко удаляется безводным фтористым водородом при ком­ натной температуре (30 мин, 20 °С). При использовании последнего иногда имеет место неполное деблокирование защищенной сульфгидрильной груп­ пы. В более мягких условиях (30 мин, О °С) отщепляется безводным фтори­ стым водородом и-метоксибензильная (MBzT) группа; ее целесообразно ис­ пользовать при твердофазном синтезе пептидов.

Позднее в качестве ценного интермедиата в пептидном синтезе были предложены 5'-ацетамидометил-Ь-цистеин (Аст) и б'-бензамидометил-Ь- цистеин (Ват). Последний получают обработкой хлоргидрата L-цистеина

§ 10.7. Блокирование боковых групп в аминокислотах

235

N-гидроксиметилбензамидом в безводной трифторуксусной кислоте (45 мин, комнатная температура):

+	ft	CF3COOH (безв.)		. +
СГ NH3-CH -COOH +	Ph-CH2-C-NH-CH2-OH ----------------		► CF3COO NH3-CH-COOH
СН				С Н 2	о
I 2				I	II
SH				S -C H 2-N H -C -C H 2-Ph

itaw-группа устойчива к действию щелочи, гидразингидрата и других аналогичных соединений. Удаление Я-бензамидометильной группы проводят в водно-метанольном растворе в присутствии ацетата ртути (1 ч, комнатная температура). По завершении процесса через раствор пропускают ток серо­ водорода и образующийся осадок сульфида ртути удаляют фильтрованием:

V^-NH-CH—СО-^		1} Hg2+	Va-NH-CH—CO-^v
С Н ,	о	" ■ Ll o' ^	С Н 2	II
' 2		2 ) H 2S	1	+ P h -C H 2- C -N H -C H 2-O H
S “ C H 2- N H -C -C H 2-P h			S H

+ HgS

Acm-Gys легко получить из ацетамидометанола и цистеина в присутствии кислоты. Производное цистеина устойчиво в широком диапазоне кислых и щелочных условий:

NH— С Н -С О О Н	ft	NH— СН— СООН
I	сн3-с-мн-сн2-он	I
I	►	I	II
SH	HCI	s - c h 2-n h -c -c h 3

Ацетамидометильная (Acm) группа гладко удаляется при pH 4 в присут­ ствии иона Hg2+ (60 мин, 20 °С).

Особого внимания заслуживает окислительное отщепление действием йода с непосредственным образованием содержащих дисульфидную группи­ ровку пептидов цистеина. Этот процесс может идти как внутри-, так и межмолекулярно.

Аналогично дисульфидные связи образуются в пептидах при окислитель­ ном отщеплении в присутствии йода тритильной (Trt) (в нуклеотидной химии Тг) защиты. Если окисление йодом проводить в трифторэтаноле, то можно добиться избирательного деблокирования Trt защиты с образованием дисульфидных производных при сохранении Acm-Cys. Тритильную защиту можно ввести путем взаимодействия цистеина с тритиловым спиртом в при­ сутствии BF3-Et20:

236	Глава 10. Химический синтез пептидов и белков
F m oc-N H -	-СООН		Fmoc-NH—СН—СООН
	Ph	BF3 • Et20	СН,
	+ P h - С—ОН
			I 2
			S

Ph

P h - С- P h

Ph

Таким образом, в распоряжении исследователей, работающих в области пептидного синтеза, и фирм-производителей пептидов имеется широкий спектр защитных групп, из которых можно выбрать нужные с учетом плани­ руемого метода синтеза и экономичности планируемого метода.

§ 10.8. Механизм рацемизации производных аминокислот и пептидов

Белки состоят из L-аминокислот, поэтому при их химическом синтезе следует исходить из мономеров именно такой конфигурации, а в процессе синтеза рацемизация должна быть сведена к минимуму. Рацемизация хирального a -центра, т. е. полная или частичная потеря оптической чистоты одного или более аминокислотных остатков, является одним из основных осложнений при пептидном синтезе. Она приводит к образованию оптически неоднородных продуктов, разделение которых по мере удлинения цепи резко осложняется и превращается в практически неосуществимую задачу. Зависи­ мость свойств пептида от его оптической чистоты можно проиллюстрировать на очень простом примере. Нередко использующийся в кондитерской инду­ стрии дипептид - метиловый эфир L-аспартил-Ь-фенилаланина, получивший название аспартам (Asp-Phe-OMe), который в 200 раз слаще сахарозы, об­ ладает сладким вкусом только в том случае, если обе аминокислоты в его составе - L-изомеры. Если при синтезе аспартама произойдет замена L-Asp на D-Asp, получается безвкусное соединение.

Аминокислоты особенно легко подвергаются рацемизации, когда они ацилированы по а-аминогруппе. В этом случае в отсутствие особых эффектов боковой группы или заместителя при азоте защитной группы наиболее суще­ ственным процессом является образование 5(4Н)-оксазолона (азлактона). Протон последнего подвижен в щелочных условиях. В случае отрыва а-протона он может присоединиться вновь с любой стороны плоскости коль­ ца, что приводит к потере оптической чистоты. Такое превращение может произойти в процессе введения защитной группы или при образовании пеп­ тидной связи.

Более того, 5(4Н)-оксазолоны могут принимать участие в реакциях обра­ зования пептидной связи, так что в процессе синтеза они исчезают, вызывая появление рацемических аминокислотных остатков в конечном белковом продукте. На образование оксазолона оказывает сильное влияние природа

§ 10.8. Механизм рацемизации производных аминокислот и пептидов

237

/V-ацильного заместителя, а также растворитель и сила основания. При пла­ нировании пептидного синтеза все эти факторы следует принимать во вни­ мание. Способ активации карбоксильной группы должен быть выбран такой, чтобы свести к минимуму образование 5(4Н)-оксазолона:

	г	О	(активированный карбонил	f	основание
					е
		'/ .-у	или пептидная связь)
	/ *	у \ 1	X - уходящая группа

			/ г Ч
	ацильная	а-углеродныи атом	Y	“Y 0
	защитная	L-аминокислоты
основание	фуппа		Y	Y
		промежуточный 5(4Н)-оксазолон

>0

Y -C -N H -C H -C -N H -R ’	H 2N-R'
4
R
оптически неактивныи продукт	протон может присоединяться	|
	с любой стороны плоскости	I

резонансно-стабилизированный карбанион

Другой важный механизм рацемизации состоит в отщеплении атома во­ дорода от а-углеродного атома и последующей енолизации:

н		г		^•NH-C-C		-	/^-NH-C=C			HY
•^NH-C-C					\			\		A ^ -N H -C -C
1	\	*	-ВН	1		Х	1		>	/V	N
R				R			R			R	Н
(L)										(D, L)

По такому механизму происходит рацемизация аминокислот. В случае пептидов рацемизация через образование енолят-аниона примерно в 100 раз менее вероятна, чем через образование 5(4Н)-оксазолона.

Рацемизация существенно подавляется, если при образовании пептидной связи в реакционную систему вводятся нуклеофильные добавки. Исследова­ ние влияние таких добавок было проведено в модельной системе

7/a-L -P ro -L -ValO H + L-ProOtBu -» Tfa-L-Pro-L-Val-L-ProO fSu

(Tfa - трифторацетильная защита; -OtBu - /г?/?е/я-бутиловый эфир)

Синтез проводился карбодиимидным методом в полярном растворителе (диметилформамид), который благоприятствовал рацемизации. Данные пред­ ставлены в табл. 16.

238	Глава 10. Химический синтез пептидов и белков

Таблица 16 Степеньрацемизации модельного пептида в присутствии нуклеофильных добавок

Нуклеофильная

добавка

Без нуклеофила

ф

о X

1 о X

да

о У

	Кол-во ис-	Степень ра­
Название	польз. реаген­	цемизации в
	та, моль	ДМФА, %
—	-	38
пентахлорфенол	2	27

УУ-гидроксисукцинимид

2

17,2

1-гидрокси-	1	3,4
бензотриазол
3-гидрокси-4-оксо-З,4-	1	1,0
дигидро-1,2,3-
бензотриазин

Видно, что в присутствии 1-гидроксибензотриазола и З-гидрокси-4-оксо- 3,4-дигидро-1,2,3-бензтриазина рацемизация практически полностью подав­ ляется.

Одной из нуклеофильных добавок, предотвращающих рацемизацию, яв­ ляется пентафторфенол. Его используют часто в составе так называемого «F-комплекса», состоящего из трех молекул пентафторфенола и одной моле­ кулы ДЦК. Для получения комплекса составляющие его компоненты инку­ бируют в течение часа, выпавший осадок отфильтровывают и добавляют к смеси карбоксильного и аминокомпонента в эквимольных количествах. Иногда используют небольшой избыток комплекса:

§ 10.9. Твердофазный синтез пептидов. Автоматизация синтеза

239

ДЦК и водорастворимый карбодиимид в присутствии таких соединений, как 1-N-гидроксибензотриазол или 4-Л^-диметиламинопиридин, используют также для получения сложных эфиров защищенных аминокислот с целью введения защиты по С-концевому карбоксилу. Реакция идет через образова­ ние l-N-оксибензотриазоловых эфиров или N-ацилпиридиниевых солей, ко­ торые далее способны ацилировать спирты без рацемизации.

§ 10.9. Твердофазный синтез пептидов. Автоматизация синтеза

Метод твердофазного синтеза первоначально был предложен Меррифилдом для синтеза пептидов. В реализованном, в том числе в настоящее время, автоматизированном виде твердофазный синтез пептидов полипептидной цепи начинается с С-концевой аминокислоты с помощью N-защищенных аминокислот с удалением защитной группы после каждого акта образования новой пептидной связи. Наиболее практичным оказалось применение Вос- и Fmoc-аминокислот. Для сведения к минимуму рацемизации в твердофазном пептидном синтезе образование пептидных связей рекомендуется проводить либо методом активированных эфиров, либо карбодиимидным методом в присутствии нуклеофильных добавок. При этом предпочтительным являет­ ся применение водорастворимых карбодиимидов, поскольку в случае тради­ ционного дициклогексилкарбодиимида возникает проблема в связи с осаж­ дением нерастворимой дициклогексилмочевины, смешивающейся с нерас­ творимым носителем. Для связывания С-концевой аминокислоты с носите­ лем в первоначальном варианте было предложено использовать хлорметилированный сополимер полистирола и дивинилбензола. Этот полимер получил название смолы Меррифилда (Merrifield’s resin). Отщепление синтезирован­ ного полипептида от носителя и удаление постоянных защитных групп мо­ жет быть осуществлено обработкой сильной кислотой, в частности HF. На рис. 76 представлена схема твердофазного пептидного синтеза на хлорметилированном полистироле с использованием в качестве синтонов Вое- аминокислот. Поскольку удаление временной защиты в этом случае прово­ дится с помощью кислоты, то предусмотрена стадия нейтрализации (3). При использовании ^/яос-аминокислот необходимость в этой стадии отпадает.

Специфика твердофазного синтеза пептидов должна учитываться при вы­ боре защитных групп. Во-первых, в твердофазном синтезе из-за отсутствия очистки синтезируемой цепи на промежуточных стадиях ее роста особенно существенным является достижение максимального выхода на каждой ста­ дии удлинения цепи. Поэтому используется большой избыток синтона (4-5- кратный). Это увеличивает опасность побочных реакций, в связи с чем реко­ мендуется применение всего спектра защитных групп для боковых радикалов.