rabochaya_tetrad
.pdfЧЕЛЯБИНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ
КАФЕДРА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ
РАБОЧАЯ ТЕТРАДЬ ПО БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ III СЕМЕСТР
ФАКУЛЬТЕТ_____________________________
СТУДЕНТ_____________________________
ГРУППА_____________________________
ПРЕПОДАВАТЕЛЬ_____________________________
ЧЕЛЯБИНСК
2006-2007
НАСТОЯЩЕЕ УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ СОЗДАНО КОЛЛЕКТИВОМ КАФЕДРЫ БИОХИМИИ ЧЕЛЯБИНСКОЙ МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ. СОЗДАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ПОСОБИЯ БЫЛО ВЫЗВАНО НЕОБХОДИМОСТЬЮ - ПОМОЧЬ СТУДЕНТАМ В ОСВОЕНИИ СЛОЖНОГО ТЕОРЕТИЧЕСКОГО ПРЕДМЕТА - БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ.
В РАБОЧУЮ ТЕТРАДЬ ВНЕСЕНЫ ТЕМЫ ВСЕХ ЗАНЯТИЙ III СЕМЕСТРА, ВНЕСЕНЫ ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ, ЧТО ЗНАЧИТЕЛЬНО ДОЛЖНО ОБЛЕГЧИТЬ ПОДГОТОВКУ СТУДЕНТА К ЗАНЯТИЮ. СТУДЕНТ СМОЖЕТ ПОЗНАКОМИТЬСЯ ЗАРАНЕЕ С ТОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТОЙ, КОТОРУЮ ЕМУ ПРЕДСТОИТ ВЫПОЛНИТЬ. В НЕЙ СФОРМУЛИРОВАН ПРИНЦИП МЕТОДА, ЧТО ПОМОЖЕТ СТУДЕНТУ НЕ ПРОСТО ВЫПОЛНИТЬ РАБОТУ, НО И ОСМЫСЛИТЬ ЕЕ.
КАЖДОЕ ЗАНЯТИЕ ИМЕЕТ ПРИЛОЖЕНИЕ ЛИБО ОБЩЕЕ ДЛЯ ВСЕХ ФАКУЛЬТЕТОВ, ЛИБО ДЛЯ КАЖДОГО ФАКУЛЬТЕТА, ЧТО ЗНАЧИТЕЛЬНО ЭКОНОМИТ ВРЕМЯ ПРЕПОДАВАТЕЛЯ НА ЗАНЯТИИ, ДАВАЯ ВОЗМОЖНОСТИ ДЛЯ РАССМОТРЕНИЯ И ЗАКРЕПЛЕНИЯ МАТЕРИАЛА.
СТУДЕНТ МОЖЕТ САМОСТОЯТЕЛЬНО ПРОВЕРИТЬ КАЧЕСТВО СВОЕЙ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ, РЕШИВ СИТУАЦИОННЫЕ ИЛИ ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ. НЕВОЗМОЖНОСТЬ ОТВЕТА НА ВОПРОСЫ ДОМАШНИХ ЗАДАНИЙ ДОЛЖНО НАСТОРОЖИТЬ СТУДЕНТА О НЕКАЧЕСТВЕННОЙ ПОДГОТОВКЕ МАТЕРИАЛА ПО ДАННЫМ ВОПРОСАМ.
ЖЕЛАЕМ УСПЕХА В ИЗУЧЕНИИ ПРЕДМЕТА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ!
ЗАНЯТИЕ 1 ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И СТРОЕНИЕ ПРОСТЫХ БЕЛКОВ
Цель занятия. Освоить некоторые методы выделения белков из мышечной ткани. Проанализировать аминокислотный состав выделенных из мышечной ткани белков, используя цветные реакции на белки и аминокислоты.
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ
1.Белки: элементный и аминокислотный состав. Физиологическая роль белков.
2.Гидролиз белков (кислотный, щелочной, ферментативный, полный и частичный).
3.Качественное обнаружение белков с помощью цветных реакций (биуретовой, нингидриновой).
4.Хроматографические методы изучения аминокислотного состава гидролизатов белков.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ЗАНЯТИЯ
Биуретовая реакция Принцип метода: реакция основана на том, что в щелочной среде в присутствиеи
солей меди белки дают фиолетовое окрашивание, обусловленное образованием комплекса ионов меди с пептидной группировкой. Реакция позволяет обнаружить наличие пептидной связи в исследуемом веществе, и является универсальной реакцией для обнаружения веществ белковой природы.
Ход работы: в пробирку наливают 1-2 мл раствора белка, добавляют 1-2 мл 10% раствора NaОН и 1-2 капли 1% раствора CuSO4.
Результат:
Вывод:
Нингидриновая рекция Принцип метода: основан на том, при нагревании с -аминокислотами, а также
полипептидами нингидрин образует фиолетово-розоватое окрашивание. При нагревании с нингидрином аминокислоты подвергаются окислительному дезаминированию идекарбоксилированию, при этом выделяется углекислый газ, аммиак, образуется альдегид, восстановленный нингидрин конденсирует с аммиаком и окисленным нингидрином, образуя окрашенное соединение.
Ход работы: к 0,5 мл раствора белка добавить 5 капель 0,2 % водного раствора нингидрина и прокипятить 2-3 минуты.
Результат:
Вывод:
Хроматографическое разделение аминокислот на бумаге
Определение содержания отдельных амнокислот методом хроматографии на бумаге важно для изучения обмена белков и аминокислот в организме. С помощью бумажной хроматографии можно легко провести разделение аминокислот, содержащихся в гидролизате различных белков, сыворотке крови, моче и т.д.
Принцип метода. Основан на том, что различные растворители (Н-бутанол СН3СООН; фенол, насыщенный водой и др.), смачивая хроматографическую бумагу, создают на ней две фазы: неподвижную водную фазу и подвижную фазу органического растворителя. Неподвижная водная фаза образуется в силу значительной гигроскопичности бумаги, т.е. свойства задерживать определенное количество влаги на поверхности волокон целлюлозы. Органический растворитель, двигаясь по бумаге,
увлекает за собой аминокислоты, которые перемещаются с различной скоростью. Она зависит от способности аминокислот растворяться в органическом растворителе (или воде). От избирательной адсорбции, от окружающей температуры, сорта бумаги, растворителя и ряда других факторов.
Хроматографию проводят в герметических камерах, насыщенных парами растворителя.
Для проведения восходящей хроматографии на нижний конец хроматографической бумаги наносят определенный объем исследуемого раствора, высушивают, нижний край бумаги помещают в растворитель и бумагу закрепляют в этом положении. Камеру закрывают. Растворитель поднимается по бумаге и увлекает за собой аминокислоты. При этом происходит разделение аминокислот из смеси. После того, как фронт растворителя по бумаге достигнет определенного уровня, бумагу вынимают из камеры, высушивают, а аминокислоты проявляют с помощью нингидрина.
Скорость передвижения аминокислот на бумаге характеризуется коэффициентом распределения Rf. Это отношение расстояния от места нанесения аминокислоты до середины ее пятна (А) к расстоянию от места нанесения смеси аминокислот до фронта
растворителя (Б) |
А |
|
Rf.= ---- |
|
Б |
Rf. является величиной, характерной для каждой аминокислоты, и постоянен при данных условиях опыта.
Ход работы. На конце полоски фильтровальной бумаги размером 1х15см сделать прокол иглой, продеть нитку, завязать петлю. На противоположном конце простым карандашм, отступив от края на 1 см, нанести кружок, в который наносят смесь аминокислот.
На дно пробирки, не задевая стенок, поместить 1,5 мл растворителя. Придерживая за нитку, опустить бумажку до соприкосновения ее нижнего краяс ратворителем и закрыть пробирку, чтобы бумажка висела на нитке, касаясь нижним краем растворителя. Через час бумагу вынимают, просушивают, смачивают 0,5% раствором нингидрина в ацетоне, снова просушивают, и помещают в термостат на 15 минут при температуре 55 С в темноте. Отмечают появление фиолетовых пятен. Проводят расчет для каждой аминокислоты.
Результат.
Вывод.
ДОМАШНЕЕ ЗАДАНИЕ:
1.Повторить классификацию и строение аминокислот (знать формулы)
2.Повторить типы связей в молекулах белка, стабилизирующих первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуры.
3.Знать образование ди-, три- и полипептидов и их название.
4.Повторить методы изучения аминокислотного состава белков с помощью цветных реакций и хроматографии.
ЛИТЕРАТУРА:
1.Лекции по курсу биологической химии
2.Северин Е.С. Биохимия . М. 2003
3.Николаев А.Я. Биологическая химия. 2001
4.Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. 1998
5.Строев Е.А.Биологическая химия. 1986
6.Северин Е.С., Алейникова Т.Л., Осипов Е.В.. Биохимия. М. 2000
7.Северин Е.С., Николаев А.Я. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами. М.
2001
СПИСОК ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:
1.Страйер Л. Биохимия М. Мир. 1984
2.Уайт А., Хенглер Ф. Смит Э. и др. Основы биохимии, М. 1981
3.Марри Р. Греннер Д. Биохимия человека, 1993
Занятие 2 Физико-химические свойства белков
Цель занятия: познакомить студентов с методами разделения и очистки белков
ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ
1.Физико-химические свойства белков. Молекулярный вес, размеры и форма молекул. Растворимость, ионизация, гидратация.
2.Белки как амфотерные электролиты. Механизм возникновения электрического заряда у белковой молекулы. Факторы, определяющие величину и знак заряда. Понятие изоэлектрической точки белков.
3.Обратимое осаждение белков – высаливание; механизм и факторы, вызывающие процесс.
4.Лабильность пространственной структуры белков и их денатурация. Факторы, вызывающие денатурацию. Шапероны – класс белков, защищающий другие белки от денатурации в условиях клетки и облегчающие формирование их нативной структуры.
5.Методы выделения индивидуальных белков: гель-фильтрация, ионообменная, афинная хроматография.
6.Методы очистки белков от низкомолекулярных примесей (диализ, ультрафильтрация). Применение.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ЗАНЯТИЯ
Высаливание белков сыворотки
Принцип метода: Высаливание белков сыворотки крови (NH4)2SО4 может быть использовано для разделения альбуминов от глобулинов в связи с тем, что глобулины осаждаются при 50% насыщении, а альбумины при 100% насыщении (NH4) 2SО4.
Ход работы. Налить в пробирку 2-3 мл сыворотки крови и добавить равный объем насыщенного раствора (NH4) 2SО4. Через 15 минут осадок отфильтровать и к фильтрату добавить сухого (NH4) 2SО4 до полного насыщения. Осадок через 10 минут отфильтровать. Для доказательства обратимости высаливания полученные осадки прямо на фильтрах смочить 2-3 мл дистиллированной воды. Отметить растворение их. С фильтратами проделать биуретовую пробу.
Результат:
Вывод:
Тепловая денатурация белков
Принцип метода. При нагревании глобулярных белков происходит их тепловая денатурация. При этом белки выпадают в осадок Ход работы. Налить в пробирку 2-3 мл раствора белка, добавить 2-3 капли 5% расвора уксусной кислоты и нагреть до кипения.
Результат:
Вывод:
Осаждение белков органическими растворителями
Принцип метода. При длительном воздействии некоторых органических растворителей (спирт, ацетон и др.) на глобулярные белки происходит их десальватация и денатурация.
Ход работы. К 0,5 мл раствора белка осторожно по стенке прилить 1-2 мл спирта. Отметить появление белого кольца на границе наслаивания.
Результат:
Вывод:
Осаждение белков органическими кислотами
Принцип метода. Ряд органических кислот вызывает денатурацию белков. Наиболее широко в различных биохимических исследованиях для осаждение белков применяются трихлоруксусная (ТХУ) и сульфосалициловая кислоты (ССК). В медицине применяют для обнаружения белка в моче.
Ход работы. Налить в пробирку 1-2 мл раствора белка и добавить равный объем 5% ТХУ.
Результат:
Вывод:
Ход работы. К 0,5 -1 мл раствора белка добавить 5-6 капель 20 % ССК
Результат:
Вывод:
Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами
Многие концентрированные минеральные кислоты вызывают денатурацию белка. Осаждение белков азотной кислотой лежит в основе пробы Геллера, широко используемой в практике обнаружения белка в моче.
Ход работы. К 0,5 -1 мл концентрированной азотной кислоты осторожно по стенке наслоить равный объем раствора белка. На границе наслаивания отметить образование белого кольца.
Результат:
Вывод:
Домашнее задание
Решить ситуационные задачи и ответить на вопросы
1.С целью стерилизации различных объектов их обрабатывают формальдегидом. Что происходит при этом с белками?
2.Препараты, содержащие березовый деготь, обладают выраженным антимикробным действием. Предположите возможный механизм действия, исходя из того, что березовый деготь содержит в своем составе фенол.
3.Для профилактики инфекционных заболеваний контактным лицам вводят препарат из крови рековалесцентов, содержащих антитела к данному заболеванию. Этот препарат называется гамма-глобулин. Как его получить из сыворотки крови? Как очистить от примесей?
4.Вам дали две пробирки с осажденным белком. Известно, что один осадок получен при действии сернокислого аммония, а второй – после добавления ТХУ. Как отличить их? В чем сходство и в чем отличие при действии этих агентов на белок?
5. Имеются пробирки с растворами: I концентрированной азотной кислоты
II10% трихлоруксусной кислоты
III СuSO4 в10% NaOH
Опишите, какие процессы произойдут в каждой пробирке при добавлении в них раствора белка. Какие из этих реакций находят практическое применение?
Решить тестовые задания
1. Выберите правильный ответ.
Полярной незаряженной аминокислотой является: 1- изолейцин 2 - аспартат 3- глутамат 4- метионин 5- серин
2. Выберите правильные ответы.
Неполярные аминокислоты 1- изолейцин 2 - аспартат
3- глутамат
4- метионин 5- серин 6- триптофан
3. Выберите правильные ответы.
Аминокислота, располагающаяся преимущественно внутри белковой глобулы: 1- глицин 2 – аспарагиновая кислота 3 – лейцин 4 – аргинин 5 – серин
4. Выберите правильный ответ.
Аминокислота, способная образовывать ионую связь с лизином 1 - глицин 2 – аспарагиновая кислота 3 – лейцин 4 – аргинин 5 – серин
5.Выберите правильный ответ.
Первичная структура белка – это
1 - аминокислотный состав полипептидной цепи
2 - линейная структура полипептидной цепи, образованная ковалентными связями между аминокислотными остатками
3 - порядок чередования аминокислот в полипептидной цепи, соединенных пептидными связями, образованными - карбоксильной группой одной амнокислоты и - аминогруппой другой аминокислоты.
4 - структура полипептидной цепи, стабилизированная водородными связя
6. Выберите правильный ответ.
Вторичная структура белка:
а) пространственное, трехмерное расположение полипептидной цепи, фиксированной межрадикальными связями, гидрофобными взаимодействиями;
б) порядок чередования -аминокислот в полипептидной цепи, соединенных пептидными связями
в) объединение в определенном порядке двух или большего числа протомеров в молекуле олигомерного белка посредством нековалентных связей
д) способ укладки полипептидной цепи в виде -спирали
7.Выберите правильный ответ.
Третичная структура белка:
а) пространственное, трехмерное расположение полипептидной цепи, фиксированной межрадикальными связями;
б) порядок чередования -аминокислот в полипептидной цепи, соединенных пептидными связями;
в) объединение в определенном порядке двух или большего числа протомеров в молекуле олигомерного белка посредством нековалентных связей и взаимного узнавания комплементарных контактных поверхностей;
д) способ укладки полипептидной цепи в виде -спирали
8.Выберите правильный ответ.
Четвертичная структура белка:
а) пространственное, трехмерное расположение полипептидной цепи, фиксированной межрадикальными связями;
б) порядок чередования -аминокислот в полипептидной цепи, соединенных пептидными связями;
в) объединение в определенном порядке двух или большего числа протомеров в молекуле олигомерного белка посредством нековалентных связей;
д) способ укладки полипептидной цепи в виде -спирали
9. Выберите правильный ответ.
Под изменением конформации понимают:
1 – изменение аминокислотной последовательности полипептидной цепи
2 – изменение вторичной и третичной структуры полипептидной цепи 3 – замену одной простетической группы в сложном белке на другую
4– изменение взаиморасположения в пространстве субъединиц олигомерного белка
10. Выберите правильный ответ.
Функциональное многообразие природных белков обеспечивается различиями: 1 – аминокислотного состава 2 – длиной полипептидной цепи 3 – молекулярной массы
4 – чередованием аминокислот в полипептидной цепи
11. Выберите правильный ответ.
Денатурация белка – это
1- разрыв ковалентных связей в полипептидной цепи 2- нарушение вторичной структуры белка за счет разрыва водородных связей
3- нарушение нативной пространственной конформации белка за счет негидролитического разрыва нековалентных связей
12. Выберите правильные ответы.
Денатурация белка сопровождается:
1- разрушением большого числа межрадикальных связей
2- уменьшением растворимости белка
3- нарушением пространственной структуры (нативной конформации)
4- изменением первичной структуры
13. Оцените правильность утверждения:
При высаливании белок выпадает в осадок, потому что нарушается конформация белковой молекулы
1- да
2- нет
14. Выберите правильные ответы.
При высаливании белков из растворов происходит : 1 - уменьшение растворимости белка 2 – обратимое осаждение 3 – необратимое осаждение
4 – сохранение нативной конформации
5 – потеря биологических свойств
15. Выберите правильные ответы.
При денатурации белков происходит: 1 - уменьшение растворимости белка 2 – обратимое осаждение 3 – необратимое осаждение
4 – сохранение нативной конформации
5 – потеря биологических свойств
16. Выберите правильные ответы.
Факторы, вызывающие денатурацию:
1- Температура выше 60-70 С
2- Насыщенный раствор (NH4 )2SO4 3- Ионизирующее излучение 4- Сдавление, вибрация 5- Токсины, яды
СПИСОК ОСНОВНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:
1.Лекции по биохимии
2.Северин Е.С. Биохимия. М. 2003
3.Северин Е. С. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами. М. 2001
4.Березов Т.Т., Коровкин В.Ф. Биологическая химия, 1982.
5.Строев В.А. Биологическая химия, 1986.
6.Николаев А.Я. Биологическая химия,1989.
7.Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача.1984.
СПИСОК ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:
1.Страйер Л. Биохимия М. Мир. 1984
2.Уайт А., Хенглер Ф. Смит Э. и др. Основы биохимии, М. 1981
3.Марри Р. Греннер Д. Биохимия человека, 1993
Занятие 3 Белки крови. Методы разделения белков.
Цель занятия: познакомить студентов с унифицированными методами определения белка в плазме крови, с клиническим значением этих методов
Вопросы к занятию
1.Многообразие белков. Глобулярные и фибриллярные белки, простые и сложные. 2.Классификация белков по их биологическим функциям.
3.Классификация белков на семейства (сериновые протеазы, иммуноглобулины). 4.Методы количественного определения белков.
5.Электрофорез белков сыворотки крови на бумаге, в ПААГ и на других носителях. 7.Белковый спектр крови в норме и патологии.
8.Иммуноглобулины, особенности строения, избирательность, взаимодействие с антигеном. Классы иммуноглобулинов, особенности строения и функционирования. 9. Функции простых белков (альбуминов, гистонов, глобулинов).
Практическая работа
Количественное определение белка в сыворотке крови биуретовым методом Принцип метода. Реакция основана на том, что в щелочной среде в присутствиеи солей меди белки дают фиолетовое окрашивание, обусловленное образованием комплекса ионов меди с пептидной группировкой. Интенсивность окраски комплекса, которая зависит от количества белка в исследуемой пробе, измеряется на фотоэлетроколориметре (ФЭКе). Ход работы. К 5 мл биуретового реактива, представляющегособойсмесь сульфата меди, сегнетовой соли, йодистого калия и щелочи, добавить 0,1 мл исследуемого белка. Через 30 минут пробу колориметрировать на ФЭКе в кювете шириной 10 мм при зеленом светофильтре против контроля, который готовят путем добавления к 5мл биуретового реактива 0,1 мл 0,9% NaCI. Количество белка в растворе определить по калибровочному графику.
Результат.