35
Ер =	(D0	- Dк ) × 2 × 50	,	(14)
		m × V

где Ер – протеолитическая активность (в условных единицах);

D0 – оптическая плотность опытного раствора после окрашивания ;

Dк – оптическая плотность контрольного раствора после окрашивания ; 2 – коэффициент для пересчета на 1 г; 50 – общий объем вытяжки, мл;

m – навеска растительного материала, г;

V – объем вытяжки ферментного препарата, взятый для анализа, мл. Материалы и реактивы. 1 %–ный раствор казеина (см. Приложение 1, п.19);

1 %–ный раствор гемоглобина (см. Приложение 1, п. 20); жидкий азот; реактив Фолина (см. Приложение 1, п. 8); 0,5 и 1 н. NаОН; 1 н. и 0,3 н. НСl; 14 %–ная трихлор - уксусная кислота; 0,0025 М раствор СиSO4; 0,5 М раствор Na2CO3; 1/5 М фосфатный буфер рН 8,0 (см. Приложение 1, п.6).

Оборудование. Спектрофотометр; ступка фарфоровая; центрифуга; холодильник; водяная баня; колбы мерные на 50 и 100 мл; конические колбы на 100 мл; воронки; градуированные пипетки; пробирки.

4.2.4. Определение протеолитической способности (ПС)

Важным этапом технологии многих пищевых производств являются биохимические превращения белков, происходящие под действием протеолитических ферментов.

В основе определения протеолитической активности лежат различные принципы: изменение физико–химических свойств субстратов, определение убыли субстрата, учет количества продуктов протеолиза.

Контроль по убыли субстрата в основном позволяет судить об активности протеиназ, так как при этом определяется количество непрогидролизованного белка. Поэтому метод можно использовать для характеристики протеолитических препаратов, применяемых в различных отраслях промышленности.

Принцип метода. Заключается в гидролизе казеина известным количеством ферментного препарата и определении степени расщепления белка по уменьшению количества соляной кислоты, связываемой оставшимся непрогидролизованным казеином. После ферментного воздействия в течение 1 ч в опыте и перед добавлением такого же количества ферментной вытяжки в контроле ферментативную реакцию прерывают 0,1 н. раствором соляной кислоты. Казеин, оставшийся нерасщепленным, количественно осаждается сульфатом натрия. Выпадая в осадок, казеин увлекает в связанном состоянии соответствующее количество соляной кислоты. Осадки профильтровывают, а 10 мл фильтрата титруют 0,1 н. раствором NаОН. Количество NаОН, израсходованное на титрование в опыте и контроле, принимается за меру протеолитической активности анализируемого объекта.

36

Этот метод достаточно прост и удобен в работе. За единицу активности принято количество фермента, которое за 1 ч при 30° С катализирует гидролиз 1 г казеина.

Ход работы. В колбочки (плоскодонные или конические) на 100 мл набирают пипеткой по 20 мл раствора казеина и помещают на водяную баню с температурой 30

°С. Через 10 мин в них наливают при перемешивании 10 мл ферментного раствора. Общий объем (казеин и ферментный раствор) должен быть равен 30 мл, так что, если на анализ берется меньше 10 мл ферментного раствора, недостающий до 30 мл объем пополняется дистиллированной водой, которую приливают непосредственно перед введением фермента. Ровно через час в колбу приливают (тоже при перемешивании) пипеткой 20 мл 0,1 н. раствора НCl в 7,5 % Nа2SО4 (раствор второй) и немедленно фильтруют до полной прозрачности (возвращая фильтрат на тот же самый фильтр). Контроли (два параллельных определения) ставят таким же образом, только до введения ферментного раствора прибавляют смесь НCl с 7,5 % Nа2SО4 и колбы не выдерживают на водяной бане, а раствор сразу фильтруют. В 20 мл фильтрата контроля и опыта оттитровывают 0,1 н. раствором NаОН избыток НСl. Титрование ведут в присутствии двух капель 0,5 %–ного спиртового раствора крезолрота до красного окрашивания. Разность титрований (опыт–контроль) в пересчете на 10 мл фильтрата может составить 0,4–2,5 мл. Если она менее 0,4 или более 2,50 мл, анализ повторяют с большей или меньшей дозировкой фермента, меняя количество вводимого ферментного раствора или его разведение.

Расчет активности. По разности титрования опыта и контроля в миллилитрах 0,1 н. NаОН в перерасчете на 10 мл фильтрата находят единицы активности (см. Приложение 2, табл. 2). В табл. 2 (см. Приложение 2) приведены также значения протеолитической способности при условии, что на анализ введено 10 мл ферментного раствора в разведении 1:100 или 1:50.

Для других количество введенного раствора или других разведений пересчет

	ПС производят по следующей формуле:
	Ер =	е	,	(15)
		m

где Ер – протеолитическая способность; е – количество единиц, найденное по таблице 2 (см. Приложение 2) в соот-

ветствии с результатами титрования;

m– навеска препарата, соответствующая 20 мл фильтрата (1/5 общего количества, взятого на анализ), г.

Пример расчета. 1. Для анализа брали 10 мл ферментной вытяжки 1:50. На титрование опыта пошло 4,2 мл 0,1 н. раствора NаОН, на титрование контроля – 2,0 мл. Разность титрования в пересчете на 10 мл фильтрата /4,2–2,0/:2 = 1,1 мл 0,1 н. раствора NаОН. Величина 1,1 соответствует по таблице Ер = 1,868.

2. Для анализа брали 5 мл раствора очищенного препарата 1:1000. Разность титрований опыта и контроля равна 1,8 мл 0,1 н. раствора NаОН. Величина 1,8 соответствует по таблице 2 (см. Приложение 2), 0,1353 ед. вычисляем " Ер".

37

В 5 мл раствора 1:1000 содержится 0,005 г фермента. Эти 0,005 г находятся в 50 мл реакционной смеси, а в 10 мл фермента 0,001 г.

Е р = 0,13530,001 = 135,3

Полученные величины активности округляют: для культур и сиропов до 0,01, а для очищенных препаратов – 0,1.

Материалы и реактивы. 1. 5 %–ный щелочной раствор казеина (см. Приложение 1, п.13); 0,1 н. раствор НСI в 7,5 %–ном растворе Nа2SО4; 0,1 н. раствор NаОН; индикатор – 0,5 %–ный спиртовой раствор крезолрота; раствор фермента (см. Приложение 1, п.14).

4.2.5. Определение протеолитической активности молокосвертывающих препаратов

Молокосвертывающие препараты, помимо молокосвертывающей активности, обладают и протеолитической активностью, т.е. способностью расщеплять белки молока.

Всвязи с острым дефицитом в сыродельной промышленности натурального химозина (сычужный фермент) все большее применение находят его заменители микробного и животного происхождения. Однако не все препараты могут успешно заменять сычужный фермент. Препараты, имеющие высокую протеолитическую активность, вызывают глубокий гидролиз казеина, что приводит к резкому снижению качества сыра (появлению горечи). В связи с этим при определении пригодности како- го–либо препарата в качестве заменителя сычужного фермента необходимо исследовать его протеолитическую активность.

Особенностью действия указанного препарата на казеиновую молекулу является избирательная атака им связи фенилаланил–метионин к–казеина, что в свою очередь приводит к открытию остатков фосфорной кислоты и объединению молекул параказеина в сгусток посредством образования Са-мостиков. Схематично это можно выразить следующим образом (рисунок 7):

Далее молекула казеина практически не гидролизуется, что обеспечивает стойкость сгустка и, далее, сырного зерна. Графически это изображено на рисунке 8.

Вданном случае подъем кривой в течении 15 минут (кривая 1) отражает образование ГМП. В дальнейшем гидролиз практически отсутствует. Отклонение от этого (кривая 2) как правило приводит к нарушениям в образовании сгустка и созревания сыров. Расстояние между кривыми 1 и 2 называется мерой неспецифичного протеолиза (МНП). Чем больше эта величина, тем выше опасность появления горького, нечистого и других привкусов в готовом продукте.

						38
		HO					HO
1)	казеин	P		O	сычужный	казеин	P	O + Гликомакропептид (ГМП)
					фермент
		HO		ниезакк-
							HO
		HO			Ca2+				OH
	казеин		P	O	Ca2+	Ca2+	O	P	казеин
		HO							OH
					O-	Ca2+ O-
		казеин		P	O	O	P		казеин
					O-	Ca2+ O-
	Рисунок 7 – Схема действия сычужного фермента на молекулу казеина
							2	}МНП
	казеина						1
	продукт гидролиза
	~ 15 мин								t, мин
	Рисунок 8 – График зависимости образования продуктов гидролиза казеина от
		времени реакции

39

В данной работе ставится задача определить пригодность испытуемого препарата в качестве заменителя сычужного фермента исходя из интенсивности гидролиза казеина во времени.

Принцип метода. Определение активности сычужного фермента и его заменителей микробного и животного происхождения основано на учете накопления продуктов гидролиза казеина, растворимых в 1,125 М трихлоруксусной кислоте через определенный промежуток времени от начала реакции.

Ход работы. В пробирки отбирают по 2 мл приготовленного казеинового субстрата и термостатируют 5 мин. при температуре 35 °С. Затем вносят по 0,5 мл раствора ферментного препарата с одновременной фиксацией времени. Реакцию прекращают через 5, 10, 15, 20, 30, 40, 90 минут путем добавления 5 мл 1,125 М раствора ТХУ. Полученную смесь перемешивают и оставляют на 30минут, после чего ее фильтруют через двойной складчатый фильтр. Параллельно с указанным определением ставятся нулевая и холостая пробы.

Для нулевого значения в пробирку отбирают 2 мл раствора субстрата, 5 мл 1,125 М раствора ТХУ и 0,5 мл раствора ферментного препарата.

Результат холостого опыта исключает экстинцию реактивов. Для этого к 5 мл 1.125 М раствора ТХУ добавляют 2,5 мл дистиллированной воды и фильтруют так же, как и в случае нулевого опыта через 30 минут. В фильтрате определяют продукты гидролиза казеина, растворимые в 0,75 М растворе ТХУ. Определенное количество фильтрата (не более 1 мл) отбирают в пробирки с таким расчетом, чтобы концентрация полученных продуктов распада казеина во время колориметрирования находилась в пределах от 20 до 150, нейтрализуют равным количеством 0,75 М раствора NaOH ( с целью обеспечения необходимого значения рН для реакции с медным и фенольным реагентами), добавляют дистиллированную воду до объема 2 мл, а затем все необходимые реактивы, предусмотренные методом Лоури. После 45–минутной экспозиции замеряют экстинцию при 750 нм по отношению к значению холостого опыта.

Для построения калибровочной кривой (20 – 200) служит казеин по Гамммарстену (см. Методические указания к выполнению УИРС по биохимии для студентов спец. 1017, работу № 5 "Определение белка в молоке по методу Лоури"). Предполагается, что продукты распада казеина дают те же экстинции, что и неизменный казеин.

Опыт проделывают трижды.

Расчет полученных данных

Протеолитическая активность показыват, какое количество мг белка казеина переводится в растворимую форму одним миллиграммом ферментного препарата

при 35 °С, рН 6,6, за определенный промежуток времени. Расчет протеолитической активности (Ер) производится по следующей формуле: