- •Производные 1,4-бензодиазепина
- •Пути метаболизма
- •Методы определения производных 1,4-бензодиазепина в биологических объектах
- •Определение 1,4-бензодиазепинов после гидролиза
- •Количественное определение
- •Транквилизаторы. Производные 1,4-бензодиазепина.
- •Особенности хта на наличие 1,4-бензодиазепинов по нативным соединениям и их метаболитов.
- •Изолирование, обнаружение и определение 1,4-бензодиазепинов в биожидкостях.
Количественное определение
Для количественного определения бензодиазепинов предложены методы ВЭЖХ и фотометрии.
Метод ВЭЖХ. Для количественного определения бензодиазепинов и бензофенонов используют метод добавок, методы внешнего и внутреннего стандарта.
Метод добавок. Анализ проводят с экстрактом из биологического объекта или с элю- атом после проведения твердофазной экстракции с добавлением в него определенного количества (эталонный раствор) обнаруженного бензодиазепина или бензофенона.
Метод внешнего стандарта. Вслед за анализом с помощью ВЭЖХ исследуемого экстракта или элюата проводят определение в тех же условиях эталонного раствора, концентрация которого близка к концентрации анализируемого соединения в извлечении из объекта.
Метод внутреннего стандарта. В биологический объект до начала его пробо-подготовки к анализу добавляют известное количество вещества, принятого за стандарт. Фотоколориметрия по реакции образования азокраснтеля (реакция Браттона- Маршалла). Метод основан на гидролизе бензодиазепинов до аминобензофенонов. Сухой остаток хлороформного экстракта или элюата растворяют в 5 мл 2 М раствора хлороводородной кислоты, добавляют 1 мл 0,1% раствора нитрита натрия, через 5 мин - 0,5 мл 1% раствора сульфамата аммония (или насыщенного раствора мочевины). Полученный раствор встряхивают до полного удаления пузырьков газа, после чего добавляют 1 мл 0,1% раствора N-1-нафтилэтилендиаминдихлорида. Оптическую плотность окрашенного раствора измеряют через 15 минут на ФЭК-56 М в кювете с толщиной слоя 10 мм и зеленым светофильтром. Раствор сравнения - смесь реактивов.
Транквилизаторы. Производные 1,4-бензодиазепина.
Из отдельных препаратов 1,4-бенздиазепинов наибольшее кол-во отравлений приходится на элениум и седуксен.
Хлордиазепоксид (7-хлор-2-метиламино-5-фенил-3Н-1,4-бензодиазепин-4-оксид, элениум, декадил, либриум и т.д.) - белый или светло-желтый кристаллический порошок, хорошо растворим в воде, кислой среде.
Токсикодинамика. Производные диазепина – транквилизаторы, выделено 6 основных видов действия: транквилизирующее, седативное, активирующее, снотворное, миорелаксантное и противосудорожное. Относится к малым транквилизаторам, оказывает успокаивающее действие на ЦНС, обладает противосудорожной активностью, потенцирует действие снотворных и анальгетиков, проявляет умеренный снотворный эффект вызывает мышечное расслабление, не нарушая передачу возбуждения в синапсах (как курареподобные в-ва), блокирует передачу импульса в области вставочных нейронов. Действие препарата обусловлено уменьшением возбудимости миндалевидных образований передних отделов височных долей на диэнцефальном и лимбическом уровнях. Применяется при невротичсских состояниях, неврозах, миозитах, кожных заб-ях, сопровождающихся зудом. Терапевт. доза 13 мг/л, токсич. доза 5,5 мг/л, ЛД 20 мг/л, для взрослого 0,1-0,15 г/кг, у детей 0,02-0,15/кг массы тела. Тяжелые отравления у детей в возрасте 7-14 лет возникали при приеме 29 таблеток элениума, у взрослых смертельные отравления наблюдались при приеме 68-120 таблеток.
Токсикокинетика. Отравления – суицид, несчастный случай. Быстро всасывается из ЖКТ благодаря кислой среде. Т1/2 хлордиазепоксида в плазме составляет 22-24ч. Хорошо разрушается и лишь небольшая часть в неизмененном виде выделяется почками. Метаболитами является N-десметилхлордиазеноксид, демоксепам и дезоксидемоксепам. С мочой выделяются неизмененный хлордиазепоксида и его метаболиты, и их конъюгаты. Элениум, так же как и морфин, обладает способностью выделяться из крови в желудок.
Объекты ХТА на бенздиазепины – желудок и тонкий кишечник с содержимым, кровь, моча, печень, почку, головной мозг. Во внутренних органах выявляют препарат, либо конечный продукт его распада: 2-амино-5-хлор-бензофенона (АХБ) и 2-метиламино-5-хлорбензофенона (МХБ).
Учитывая метаболизм нитразепама, который при транспортировке и хранении следует замораживать.
ХТА. Изолирование. Экстрагируется орг.растворителями из щелочных водных р-ров. Биоматериал трижды настаивают с новыми порциями насыщенного водного р-ра щавелевой кислоты (рН1). Через 1 ч после каждого настаивания вытяжки отделяют от биоматериала центрифугированием. Объединенный кислый центрифугат трижды взбалтывают со смесью (1:1) хлороформа и этилацетата (по 20, 15, 15мл), затем кислый центрифугат подщелачивают до рН10 и трижды взбалтывают с новыми порциями (20, 15 и 15мл) смеси хлороформа и этилацетата (1:1). Полученные при этом вытяжки подвергают исследованию на наличие нитразепама.
Индивидуальные реакции обнаружения нативных 1,4-бензодиазепинов.
Качественное обнаружение хлордиазепоксида и др. бенздиазепинов.
I. Цветные реакции. 1. Реакция с нингидрином. К 2-3 мл р-ра диазепама в этаноле + около 10 мг нингидрина, 2 мин нагревают на водяной бане, + 5 мл этанола, р-р приобретает синюю окраску, которая от + 2 кап 1% CuSO4 (II) переходит в красную или в оранжево-красную. В указанных условиях нитразепам дает желто-коричневую, а хлордиазепоксид - коричневую окраску.
2. С реактивом Марки образует оранжево-желтую окраску.
3. С реактивом Фреде дает оранжевую окраску.
4. В реакции Витали – Морена дает желтую окраску.
Предварительные пробы на наличие нитразепама в моче (в неизмененном виде и в виде 7-амино и 7-ацетиламино-производных). Обнаружение нативного нитразепама в моче. 5 мл мочи подщелачивают аммиаком до рН 10 и + 250 г дитионита натрия (Na2S201). Смесь взбалтывают 10 мин, нагревают при 50°С 1 ч и охлаждают. Охлажденную жидкость 10 мин взбалтывают с 10 мл смеси, состоящей из равных объемов метиленхлорида и этилацетата. От водной фазы отделяют слой орг.растворителей. Слой взбалтывают с 10 мл 5% буры. Водную фазу отделяют от фазы орг.растворителей. К последней + 5 мл 0,2 н. HCl и взбалтывают. После этого отделяют фазу орг.растворителей. 4 мл кислой водной фазы охлаждают в ледяной воде и + 0,2 мл 0,4 н. NaNO3. Через 5 мин к кислому р-ру + 0,2 мл 2% сульфамината аммония. Жидкость хорошо перемешивают и оставляют на 5 мин, + 0,2 мл 0,4% N-1-нафтилэтилендиамина дигидрохлорида. При наличии нитразепама в моче появляется вишнево-красная окраска (λ 555 нм).
Цветная реакция на оксазепам.
25-50 мл объединенной эфирной вытяжки из биоматериала выпаривают досуха. Остаток растворяют в 5 мл 6 н. HCl и фильтруют. 1 мл фильтрата вносят в колбу на 25 мл и кипятят 5-10 мин. Жидкость охлаждают и помещают в холодильник на 15 мин. К охлажденной жидкости + 1мл смеси (0,3 г KBr, 0,3 г NaNO3 в 6 мл воды). Жидкость взбалтывают и помещают в холодильник на 30 мин. Затем к охлажденной жидкости + 0.5 мл 10% мочевины. Через 15 мин + 1 мл 1% спиртового р-ра α-нафтола и 1 мл 40% водного NaOH. При наличии оксазепама появляется красная окраска, которую дает и хлордиазепоксид. Приведенная реакция м.б. использована для ФЭК-определения оксазепама.
II. ТСХ. Для обнаружения хлордиазепоксида и др. производных бензодиазепина применяют пластинки, «Силуфол», подвижная фаза – этилацетат- 25% аммиак-метанол (26:1,6:3,3 или 85:5:10 для нитразепама и его производных) или хлороформ-ацетон (9:1). Проявитель - реактив Драгендорфа.
Обнаружение оксазепама ТСХ. 5-10 мл объединенной эфирной вытяжки выпаривают досуха. Сухой оста гик растворяют в 0.5 мл этанола. 1 кап этого р-ра и PCО 0,5% р-р оксазепама в спирте наносят на линию старта на пластинке «Силуфол». Хроматографируют в системе растворителей (хлороформ-пропанол-ацетон (9:0,4:1)) Проявляют насыщенным р-ром тиосульфата натрия. При наличии оксазепама на пластинке появляются оранжевые или желтоватые пятна.
III. УФ- и ИК-спектроскопия.
В-во |
растворитель |
УФ-спектр |
Пики ИК-спектра ( KBr) |
Хлордиазепоксид |
0,1 н. NaOH |
243 и 260 нм |
1625, 1458, 760см-1 |
0,1 н. H2SO4 |
245 и 306 нм |
||
0,1 н. HCl |
246, 308 нм |
||
Диазепам |
2 н. HCl |
242, 287 нм |
1681, 1484, 1313 см-1 |
0,1 н. H2SO4 |
241, 287, 359 нм |
||
Нитразепам |
этанол |
218, 260 нм |
1692, 1615, 1352, 702 см-1 |
0,1 н. H2SO4 |
277, изгиб ~ 340 нм |
||
Оксазепам |
этанол |
230 и 315 нм |
1687, 1706, 693 и 830 см-1 |