Особенности высокоэффективной жидкостной хроматографии (жидкостной хроматографии высокого давления)

В основе разделениявеществ методом ВЭЖХ лежит обратимая сорбция вещества между жидкостью, подаваемой в колонку под высоким давлением, и твердой фазой колонки.

Основные характеристики метода приведены в таблице 1.

Таблица 1

Основные характеристики метода вэжх

Механизм распределения	Подвижная фаза	Неподвижная фаза	Температурные условия	Состояние анализируемых проб
Обратимая сорбция в системе жидкость-твердый сорбент	жидкость	Твердый сорбент	20-50^оС	Растворяются в подвижной фазе

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) является вариантом жидкостной колоночной хроматографии. Неподвижная фаза – твердый сорбент, подвижная - жидкость, подаваемая в колонку под повышенным давлением.Разделение компонентов смеси достигаетсяза счет различия в сродстве компонентов смеси к неподвижной и подвижной фазам.

Основными требованиями в методе является растворимость исследуемых веществ в подвижной фазе, а также свойство удерживаться неподвижной фазой.Если при вводе пробы какие-либо компоненты смеси окажутся нерастворимыми, они будут отфильтрованы и уже не участвуют в хроматографическом процессе. Точно также не будут разделяться компоненты, не удерживающиеся неподвижной фазой, т.к. они пройдут через колонку с подвижной фазой.

Основными узлами хроматографа для ВЭЖХявляются: насос высокого давления для подачи подвижной фазы, устройство для ввода пробы (дозатор), хроматографическая колонка, детектор с регистрирующим устройством.

Несмотря на некоторую общность узлов приборов с другими вариантами хроматографии (ГХ и ГЖХ) здесь имеются отличия:

- подвижная фаза подается под давлением (до 200-500 атм);

- колонки иных размеров (обычно длиной 10-25 см, диаметр 4-5,5 мм, в

микроколоночных хроматографах используют длиной 5-6 см и

диаметром 1-2 мм);

- размер частиц сорбента 5-10 мкм и их плотная упаковка в колонке,

что обеспечивает эффективность разделения;

-выбор сорбента ограничен;

- другие температурные условия.

В качестве сорбента в ВЭЖХобычно используютсиликагель с гидроксилированной поверхностью или привитыми к поверхности различными функциональными группами, например, алкилсиликагель, примером которого является Сепарон-18. К его поверхности привита алкильная группа с числом углеродных атомов 18.

В колонках, содержащих силикагель с привитыми неполярными группами (Сепарон-18), используют полярные растворители – водные растворы, содержащие низшие спирты и ацетонитрил. Если в качестве сорбента используют силикагель, то элюентом служат углеводороды с добавлением небольшого количества спирта.

В ВЭЖХ используются детекторыразличных типов, их основные характеристики представлены в таблице 2.

Характеристики детекторов для вэжх

Детектор	Измеряемое физическое свойство	Чувствительность, мг в пробе	Селективность
Фотометрический	Оптическая плотность при фиксированной длине волны	10 ^-10	высокая
Спектрофотометрический	Оптическая плотность при выбираемой длине волны	10^-9	высокая
Рефрактометрический	Разность показателей преломления в сравнительной и измерительной ячейках	10^-5	малая
Флуориметрический	Интенсивность флуоресценции исследуемых веществ в подвижной фазе	10^-11	очень высокая
Амперометрический	Ток окисления или восстановления электрохимически активных соединений	10^-9- 10^-10	очень высокая

Принцип анализа в ВЭЖХ. Анализируемую смесь растворяют в подвижной фазе и с помощью дозатора или микрошприца вводят в специальное устройство прибора. Туда же подается под определенным давлением и с определенной скоростью подвижная фаза. По мере продвижения подвижной фазы с растворенными в ней веществами за определенный промежуток времени на колонке происходит разделение смеси.Чем больше сродство компонента к неподвижной фазе и чем меньше к подвижной, тем медленнее он движется по колонке и тем дольше он в ней удерживается.

Анализ проводится в определенном режиме температур, что создается с помощью устройства термостатирования. Сорбент, состав подвижной фазы, скорость подачи подвижной фазы, давление, температурный режим, объем вводимой пробы устанавливаются для данной конкретной пробы.Детектор на выходе из колонки автоматически непрерывно определяет количество разделяемых соединений в подвижной фазе. Сигнал детектора регистрируется самописцем, полученная при этом диаграмма называется хроматограммой.

Хроматограмма – это кривая, отображающая зависимость концентрации анализируемых веществ в элюате от времени.Каждое вещество на хроматограмме образует кривую, которую называютпик.

W_0,5

h

h_0,5

t_m,V_m W

t_r, V_r

Рис. 2. Хроматографический пик и его основные параметры.

t_m, V_m – время или объем удерживания несорбируемого компонента;

t_r,V_r – время или объем удерживания вещества;

h– высота пика;

h_0,5 – полувысота пика;

W – ширина пика у основания;

W_0,5– ширина пика на полувысоте.