Обработка материала 4% раствором едкого натра (модифицированный метод Петрова) Общее время обработки материала щелочью не должно превышать 40 мин!

Обработка с помощью NaOH является достаточно жесткой и может приводить к гибели до 60% микобактерий, содержащихся в исследуемом образце материала. Данный показатель не зависит от дополнительной гибели бактерий за счет повышенной температуры при центрифугировании и других факторов.

Гидроокись натрия токсична по отношению как к загрязняющим микроорганизмам, так и к микобактериям туберкулеза.

Поэтому при использовании данного метода необходимо строго соблюдать указанное время обработки.

1. Исследуемый материал, находящийся в стерильном флаконе с 6-8 стеклянными бусинами или битым стеклом, залить двойным объемом 4% раствора едкого натра и поместить на 10 мин во встряхиватель.

2. Выдержать полученную со щелочью смесь 15 мин при комнатной температуре с периодическим ручным встряхиванием (не превышать время экспозиции!).

3. Стерильной пипеткой объемом 5-10 мл перенести обработанный материал в пробирки.

4. Пробирки уравновесить и центрифугировать материал при 3000 g в течение 15 мин.

4. Стерильной пипеткой объемом 5-10 мл перенести надосадочную жидкость в емкость с дезинфицирующим раствором оставив в пробирке 0,8-1,2 мл осадка.

5. К осадку добавить стерильной пипеткой 15 мл стерильного 09% раствора хлористого натрия.

6. Пробирки уравновесить и повторно центрифугировать материал при 3000 g в течение 15 мин.

7. Стерильной пипеткой объемом 5-10 мл перенести надосадочную жидкость в емкость с дезинфицирующим раствором оставив в пробирке 1,2-1,5 мл осадка.

8. К осадку добавить 1-2 капли 10% раствора соляной кислоты до получения нейтрального значения рН, определяемого индикаторной бумажной полоской.

9. Закрыть пробирку и встряхнуть ее содержимое.

10. Пробирку с осадком поместить в штатив, расположив ее по порядку регистрационных номеров материала.

Реактивы.

1. Едкий натр (NaOH) - ГОСТ-4328-77;

2. Кислота соляная (НСl) концентрированная - ГОСТ 3118-77;

Приготовление растворов.

1. 4% раствор едкого натра. 40 г едкого натра заливают дистиллированной водой до объема 1 литр.

2. 10% раствор соляной кислоты. 10 мл концентрированной соляной кислоты добавляют к 90 мл дистиллированной воды. Растворы стерилизуют 20 мин при 1 атмосфере.

4.1.2. Альтернативные методы обработки материала

В регионах с достаточными материальными ресурсами могут применяться более дорогие и трудоемкие методы гомогенизации и деконтаминации (Kent P.T., Kubica G.P. Public Health Mycobacteriology: A Guide for the Level III Laboratory. US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control, USA, 1985). К ним относятся следующие методы:

4.1.2.1 Метод с использованием n-ацетил-l-цистеина и гидроокиси натрия (nalc-NaOh)*

Применение муколитического препарата NALC, используемого для быстрого разжижения мокроты, позволяет снизить концентрацию деконтаминирующего вещества (NaOH) до конечной концентрации 1%. Цитрат натрия включен в литическую смесь для связывания ионов тяжелых металлов, которые могут присутствовать в пробе и инактивировать действие N-ацетил-L-цистеина. Этот метод дает больший выход высеваемости микобактерий, однако требует больше затрат времени и средств.