4 Лекция по БТ КИНЕТИКА

КИНЕТИКА ПРОЦЕССОВ ФЕРМЕНТАЦИИ

ОСНОВНЫЕ МОДЕЛИ И КИНЕТИЧЕСКИЕ УРАВНЕНИЯ

ДИНАМИКА ИЗМЕНЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ ПРОЦЕССА ФЕРМЕНТАЦИИ

КАК ОПИСЫВАТЬ СКОРОСТИ ПРОТЕКАЮЩИХ ПРОЦЕССОВ?

• Можно найти уравнения, описывающие изменения во времени X(t), S(t), P(t) или Q_x(t), Q_s(t), Q_p(t) или удельных скоростей μ(t), q_s (t) и q_p(t)

• Эти уравнения, однако, ничего не дают для описания закономерностей процесса. Нужны «автономные» уравнения, описывающие зависимости между кинетическими характеристиками (см. выше) и текущими концентрациями S, X, P и другими параметрами процесса

КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАВИСИМОСТИ

• Мы уже говорили о том, что кинетические характеристики процесса ферментации –μ, q_p ,q_s – не являются постоянными, а изменяются в ходе процесса

• Эти изменения связаны с тем, что существуют зависимости этих параметров от текущих концентраций субстратов (S), биомассы (X) и продуктов метаболизма (P)

ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ РОСТА ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ СУБСТРАТА

• Мы уже рассматривали одно уравнение для скорости роста биомассы

• QX = dX/dt = μX

• В этом уравнении μ постоянна

• На самом деле величина μ зависит по меньшей мере от концентрации субстрата S, которая в ходе процесса непрерывно уменьшается

• Ниже рассмотрены варианты этой зависимости

МОДЕЛЬ КОБОЗЕВА

• По аналогии с химической кинетикой можно считать, что в реакции участвуют два «реагента» - биомасса Х и субстрат S

• dX/dt = KXS (K – константа скорости)

• Или μ = KS (прямая на графике)

• Модель предсказывает неограниченное увеличение скорости роста при увеличении концентрации субстрата

МОДЕЛЬ БЛЭКМАНА

• Практически известно, что скорость роста микроорганизмов не может быть сколь угодно большой, и повышение концентрации субстрата выше определённого предела не приводит к увеличению скорости роста биомассы

• Блэкман предположил, что при достижении некоторого критического значения концентрации субстрата скорость роста становится постоянной по величине

ЗАВИСИМОСТЬ ПО БЛЭКМАНУ

УРАВНЕНИЯ БЛЭКМАНА

• dX/dt = KSX при S < S*

• dX/dt = KS*X при S > S*

• или, что то же самое:

• μ = KS при S < S*

• μ = KS* при S > S*

• В этих уравнениях K – константа скорости Кобозева, S* - критическая концентрация субстрата

МОДЕЛЬ МОНО

• В природе не бывает резких изломов зависимостей, как в модели Блэкмана

• Обычно удельная скорость роста с повышением концентрации субстрата постепенно возрастает, а затем плавно переходит в постоянное значение

• Моно предложил описать эту зависимость специальным уравнением, основанным на ферментативной кинетике

МОДЕЛЬ МОНО

0 0

S

УРАВНЕНИЕ МОНО

• dX / dt = μ_mXS / (K_s + S), или

• μ = μ_mS / (K_s + S),

• В этих уравнениях

• S – концентрация субстрата

• μ_m – константа максимальной удельной скорости роста

• K_s - субстратная константа Моно

РЕПЕРНЫЕ ТОЧКИ

• Характерные точки для графика (S) легко найти простой подстановкой в уравнение Моно :

•  = 0 при S = 0

•  = ½_m при S = K_s

•  = _m при S  

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КИНЕТИЧЕСКИХ КОНСТАНТ

• Кинетические константы, входящие в уравнения модели, определяются из экспериментальных данных путём их математической обработки с помощью специальных методов

• Некоторые из этих методов будут рассмотрены ниже на примере уравнения Моно

МЕТОД ЛАЙНУИВЕРА И БЭРКА

• Уравнение Моно можно преобразовать так, чтобы его переменные ( μ и S ) выразить в обратных величинах ( 1/μ ) и ( 1/S ):

• ( 1/μ ) = ( 1/μ_m ) + ( 1/S )*(K_s / μ_m )

• Это – уравнение прямой с «новыми» константами ( 1/μ_m ) и (K_s / μ_m ), которые можно найти графическим построением

ГРАФИЧЕСКОЕ ПОСТРОЕНИЕ

• В результате эксперимента имеется некоторое количество парных данных ( 1/μ ) и ( 1/S ) для каждой точки

• Если нанести эти данные на график в обратных координатах, получается прямая, пересекающая ось ординат в точке 1/μ = 1/μ_m, а ось абсцисс – в точке 1/S = - 1/K_S

МЕТОД КОРНИШ-БОУДЕНА

• Можно преобразовать уравнение Моно к такому виду:

• μ = μ_m – K_S(μ/S), откуда графически получается прямая в координатах μ - (μ/S). Прямая пересекает ось ординат в точке μ = μm ,а ось абсцисс – в точке (μ/S) = (μ_m/K_S)

• Таким образом, по экспериментальным данным можно найти кинетические константы процесса

ГРАФИЧЕСКОЕ ПОСТРОЕНИЕ КОРНИШ-БОУДЕНА

МОДЕЛЬ МОЗЕРА

• Для некоторых процессов зависимость скорости роста от концентрации субстрата имеет сигмоидальный характер (см. рисунок)

• Мозером предложено описывать данную ситуацию уравнением:

• μ = μ_mS^k /(K_S + S^k )

СИГМОИДНАЯ ЗАВИСИМОСТЬ

МОДЕЛЬ ПЕРТА

• Эта модель описывает влияние не лимитирующего, а «стимулирующего» субстрата

• μ = μ_о + μ₁S/(K_S + S)

• Интересно, что при S = 0 уже есть рост, то есть μ = μ_о

СТИМУЛИРУЮЩИЙ СУБСТРАТ

МОДЕЛЬ АНДРЮСА

• В этой модели учитывается ингибирование повышенными концентрациями субстрата (см. рис.)

• Зависимость описывается уравнением

• μ = μ_mS / (K_s + S + S²/K_I), где K_I – константа ингибирования

• Оптимальная концентрация субстрата

• S_opt = (K_S K _i)^0,5

ЗАВИСИМОСТЬ С ЭКСТРЕМУМОМ

ПРОДУКТ-ЗАВИСИМЫЕ МОДЕЛИ

• Во всех рассмотренных до сих пор уравнениях в качестве единственного параметра, влияющего на удельную скорость роста микроорганизмов, использовалась концентрация субстрата (т.е. это «субстрат-зависимые» модели)

• Возможны случаи, когда не субстрат, а накапливающийся в среде продукт метаболизма влияет на скорость роста, и тогда это «продукт-зависимые модели»

МОДЕЛЬ ХИНШЕЛЬВУДА

УРАВНЕНИЕ ХИНШЕЛЬВУДА:

• μ = μ_m– KP

• P – концентрация продукта метаболизма

• μ_m и K - кинетические константы

• μ = μ_m при P = 0

• μ = 0 при P = μ_m / K

МОДЕЛЬ ИЕРУСАЛИМСКОГО

УРАВНЕНИЕ ИЕРУСАЛИМСКОГО

• μ = μ_m / (1 + P / K_P ) или

• μ = μ_m K_P /(P + K_P) , где K_P – константа ингибирования, а μ_m – максимальная удельная скорость роста

• При P = 0 μ = μ_m

• При P >> μ = 0

• При P = K_P μ = 0,5μ_m

ЛИНЕАРИЗАЦИЯ УРАВНЕНИЯ ИЕРУСАЛИМСКОГО

• (1/ μ_m ) + (1/ μ_mK_P)P

• При (1/ μ) P = 0 P = - K_P

• При P = 0 (1/ μ) = (1/ μ_m )

• Графическое выражение линеаризованного уравнения представлено на следующем слайде

ГРАФИЧЕСКОЕ ВЫРАЖЕНИЕ ЛИНЕАРИЗОВАННОГО УРАВНЕНИЯ

МОДЕЛЬ БЕРГТЕРА

• Встречаются процессы, в которых зависимость μ (P) имеет сигмоидный характер

• Уравнение Бергтера:

• μ = μ_m / (1 + P ^k / K_P ), где

• K_P – константа ингибирования

• k - показатель степени, как новая константа

• Обычно k > 1

СТИМУЛИРУЮЩИЙ ПРОДУКТ МЕТАБОЛИЗМА

• Иногда встречаются процессы, в которых продукт метаболизма не ингибирует, а стимулирует рост

• Эту зависимость можно описать уравнением:

• μ = μ₀ + μ₁P / ( K_P + P )

ЧАСТИЧНО ИНГИБИРУЮЩИЙ ПРОДУКТ МЕТАБОЛИЗМА

• Бывают ситуации, когда продукт метаболизма как бы «частично» ингибирует рост (не до нуля)

• Эта зависимость может быть описана уравнением:

• μ = μ₀ + μ₁ / (1 + P / K_P )

БИОМАССА КАК ВЛИЯЮЩИЙ ФАКТОР

• На ОБЩУЮ скорость роста влияет концентрация биомассы (как сомножитель). Влияет ли концентрация биомассы на УДЕЛЬНУЮ скорость роста  ?

• Да, но это влияние не просто «эффект тесноты», а опосредствованное влияние через концентрацию ингибирующего продукта.

• Поэтому и зависимости при этом похожи, но вместо P в уравнения подставляют X.

ОТМИРАНИЕ (ДИССИМИЛЯЦИЯ) БИОМАССЫ

• Все рассмотренные ранее зависимости относятся к собственно росту микроорганизмов

• Однако в процессе роста, и особенно при его замедлении, одновременно с ростом происходит диссимиляция (отмирание) микроорганизмов. Реально измеряя биомассу, мы наблюдаем объединённый процесс роста-диссимиляции

ВАРИАНТЫ УЧЁТА КИНЕТИКИ ОТМИРАНИЯ БИОМАССЫ

• dX / dt = μX – X ( общее уравнение)

• 1) μ=0 нет отмирания

• 2) μ = K Герберт

• 3) μ = KX Ферхюльст

• 4) μ = KP Рамкришна

МНОГОФАКТОРНЫЕ КИНЕТИЧЕСКИЕ УРАВНЕНИЯ

• До сих пор мы рассматривали кинетические уравнения, в которых на скорость роста влиял только один фактор – субстрат (только один), или продукт, или биомасса.

• Но в реальности часто на процесс влияет не один, а несколько факторов. Существуют многофакторные зависимости, и прежде всего многосубстратные.

ТИПЫ МНОГОФАКТОРНЫХ КИНЕТИЧЕСКИХ УРАВНЕНИЙ

• Мультипликативные уравнения

• Аддитивные уравнения

• Альтернативные уравнения

• Уравнения с неразделяющимися эффектами факторов

• Уравнения с однородными факторами (например, многосубстратные)

• Уравнения со смешанными факторами

МУЛЬТИПЛИКАТИВНЫЕ КИНЕТИЧЕСКИЕ УРАВНЕНИЯ

• Функция является произведением однофакторных зависимостей

•  = f₁(S₁)* f₂(S₂), где S₁ и S₂ – концентрации субстратов S₁ и S₂

• Каждый фактор может иметь собственную форму зависимости, например, Моно – Моно, Моно – Перт, Моно –Андрюс, Андрюс – Андрюс и т.п.

АДДИТИВНЫЕ КИНЕТИЧЕСКИЕ УРАВНЕНИЯ

• Многофакторная функция является суммой однофакторных

• Такие зависимости встречаются довольно редко, чаще для двух-трёх субстратов одного назначения, например, глюкоза и лактоза [(S₁) и (S₂)]

•  = ₁S₁/(K₁ + S₁ ) + ₂S₂/(K₂ + S₂ ), где K₁ ,K₂ , ₁, ₂ – кинетические константы

АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ КИНЕТИЧЕСКИЕ УРАВНЕНИЯ

• Многофакторная зависимость подчиняется принципу кинетического минимума

• Для каждого субстрата существует своя зависимость _i(S_i). Реализуется та из них при заданных < S_i > , для которой _i(S_i) минимален:

КИНЕТИЧЕСКИЕ УРАВНЕНИЯ С НЕРАЗДЕЛЯЮЩИМИСЯ ПЕРЕМЕННЫМИ

• Все три рассмотренных варианта многофакторных уравнений формируются из однофакторных зависимостей

• В сложных случаях многофакторную зависимость трудно разбить на однофакторные. Например, уравнение «конкурентного торможения» вторым субстратом S₂:

• μ = μ_mS₁ /(K_S + S₁ + S₂ / K _i )

ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ

• Температура оказывает влияние на константы скорости кинетических уравнений роста микроорганизмов

• В принципе любая из констант в той или иной мере может быть подвержена влиянию температуры

• Однако в кинетических уравнениях для роста чаще всего полагают, что температура влияет на максимальную удельную скорость роста _m

ЗАКОН АРРЕНИУСА

• По аналогии с химической кинетикой температурное влияние часто пытаются описывать законом Аррениуса:

• _m = _m0 e^{- E/RT}

• _m0 – предэкспоненциальный множитель

• E – энергия активации

• R – универсальная газовая постоянная

• T – абсолютная температура

НЕДОСТАТКИ УРАВНЕНИЯ АРРЕНИУСА

• Уравнение описывает только возрастание констант с повышением температуры

• Реальная зависимость имеет вид кривой с экстремумом

• При этом ниспадающая часть этой кривой круче, чем восходящая

«ДВОЙНОЙ АРРЕНИУС»

• В клетках микроорганизмов одновременно протекают процессы синтеза и распада клеточного материала

• При этом зависимость «объединённой» константы _m от температуры отображает разность двух сопряжённых процессов, каждый из которых подчиняется закону Аррениуса со «своими» константами:

• _m = ₁ e^{- E1/RT} - ₂ e^{- E2/RT}

ЭМПИРИЧЕСКИЕ УРАВНЕНИЯ ЗАВИСИМОСТИ ОТ ТЕМПЕРАТУРЫ

• Часто для описания  _m (Т) используют уравнение  _m = ₀ + ₁T + ₂ T²

• Здесь ₀ , ₁ и ₂ - коэффициенты, определяемые из экспериментальных данных

• Это уравнение, однако, описывает только СИММЕТРИЧНЫЕ зависимости

• Более точно – уравнение более высоких порядков:  _m = ₀+ ₁T + ₂T² + ₃T³ + ₄T⁴

ВИД ЗАВИСИМОСТИ _M(РН)

ЗАВИСИМОСТЬ _M(РН)

• Величина рН = - lg [H⁺]

• [H⁺] = 10^-pH [г-ион/литр]

• В водных растворах: [H⁺] * [OH^-] = 10^-14

• [OH^-] = 10^{-(14 – pH)} [г-ион/литр]

• Влияние рН осуществляется «через» влияние либо водородных, либо гидроксильных ионов

• Поэтому можно использовать уравнения (P), подставляя вместо продукта P либо [H⁺] для левой ветви кривой, либо [OH^-] – для правой . Или использовать эмпирическое уравнение:  _m = ₀+ ₁pH + ₂(pH)² + ₃(pH)³ + ₄(pH)⁴

МОДЕЛИ КИНЕТИКИ БИОСИНТЕЗА ПРОДУКТА

• Q_P = q_P X

• q_P – удельная скорость биосинтеза продукта метаболизма

- Функция от удельной скорости роста 

- Функция от концентраций субстратов и продуктов метаболизма

- Функция от возраста культуры

ОБОСНОВАНИЕ РОСТ-ЗАВИСИМЫХ МОДЕЛЕЙ БИОСИНТЕЗА

• Предполагается, что комплексный показатель – удельная скорость роста микроорганизмов , зависящий от многих параметров, «вбирает в себя» всё влияние этих параметров, и его можно использовать как параметр-аргумент в уравнениях, описывающих кинетику биосинтеза продукта

• На этом предположении основаны уравнения, предложенные и использованные для различных процессов биосинтеза продуктов – связанных с ростом и «вторичных» метаболитов

РОСТ-ЗАВИСИМЫЕ МОДЕЛИ

• 1 – прямая связь с ростом:

• q_P =K

• 2 – Людекинг и Пайри : q_P =K + q_P0

• 3 – q_P =a /(b + )

• 4 – q_P =a /(b - )

• 5 – [3] + q_P0

• 6 – [4] + q_P0

РОСТ-ЗАВИСИМЫЕ МОДЕЛИ

• Зависимости с экстремумом

• (7 ) q_P = b -c ²

• (8 ) q_P = a +b + c²

НЕДОСТАТКИ РОСТЗАВИСИМЫХ МОДЕЛЕЙ БИОСИНТЕЗА ПРОДУКТОВ

• «Рост-зависимые» модели неявно предполагают, что совсем неважно, каким образом формируется то или иное значение удельной скорости роста μ. Например, уменьшить μ можно, снизив концентрацию лимитирующего субстрата, или увеличив или понизив величину рН или температуры.

• Такое предположение справедливо для процессов биосинтеза продуктов, связанных с ростом.

НЕДОСТАТКИ РОСТЗАВИСИМЫХ МОДЕЛЕЙ БИОСИНТЕЗА ПРОДУКТОВ

• Для процессов, НЕ связанных с ростом, важно, каким именно образом достигается снижение величины μ.

• Лимитирование концентрациями углеродного, или азотного субстрата, или кислорода, или повышение рН, или снижение температуры, давая ОДНО И ТО ЖЕ значение μ, могут давать совершенно разные скорости биосинтеза продукта метаболизма q_P

МОДЕЛИ КИНЕТИКИ БИОСИНТЕЗА С ВНЕШНИМИ ПАРАМЕТРАМИ-АРГУМЕНТАМИ

• Для таких процессов необходимо использовать уравнения, описывающие зависимости q_P непосредственно от внешних факторов – концентраций субстрата S, или продукта P, и/или температуры и/или pH

ВАРИАНТЫ СУБСТРАТЗАВИСИМЫХ УРАВНЕНИЙ КИНЕТИКИ БИОСИНТЕЗА

• qP = q_mS / (K_S + S) (Моно)

• q_P = q_mS / (K_S + S + S² / K_i) (Андрюс)

• q_P = q_m[ S₁ / (K₁+S₁)]*[S₂ /(K₂+S₂+S₂² / K_i)] (Моно-Андрюс)

• q_P = q_mS / (K_S+S) (1+P/K_P) (Моно-Иерусалимский)

• q_P = q_mS / (KX + S) (Контуа)

КИНЕТИКА ДЕГРАДАЦИИ ПРОДУКТОВ МЕТАБОЛИЗМА

• Часто продукты биосинтеза бывают лабильными. Они разрушаются в процессе самой ферментации.

• В материальный баланс продукта в таких случаях следует

включать скорость деградации (инактивации) продукта.

ВАРИАНТЫ ОПИСАНИЯ КИНЕТИКИ ДЕГРАДАЦИИ ПРОДУКТА

• = 0 (стабильный продукт)

• = K (не имеет смысла при P = 0)

• = KP (кинетика 1-го порядка)

• = KPⁿ (кинетика n-го порядка)

• = KPX (деградация с участием не только самого продукта, но и биомассы)

КИНЕТИКА ПОТРЕБЛЕНИЯ СУБСТРАТА

• Чтобы «замкнуть» материальный баланс, в котором почти везде участвует концентрация субстрата, необходимо дополнить его уравнением кинетики потребления субстрата.

• Это уравнение в общем виде может быть представлено как аддитивное, в правой части которого фигурируют затраты на собственно рост микроорганизмов (Q₁), на образование продукта метаболизма (Q₂) и на поддержание жизнедеятельности (Q₃):

• - dS/dt = Q₁+ Q₂+ Q₃

• Q₁=Q_X /Y_XS ( рост) и Q_P /Y_PS (образование продукта)

ПОДДЕРЖАНИЕ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ - 1

• В клетках микроорганизмов всё время идут процессы деградации (разрушения) некоторых веществ (белков, нуклеиновых кислот и др.) и одновременно процессы их синтеза (репарации). На этот процесс необходимо расходовать часть субстрата .

• Кроме того, субстрат расходуется на синтез определённых, но неизмеряемых продуктов, образующихся в небольшом количестве

ПОДДЕРЖАНИЕ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ - 2

• В процессе ферментации можно создать режим, при котором концентрация биомассы и продукта не изменяются (то есть ΔX = ΔP = 0), а субстрат всё время добавляется, предотвращая отмирание биомассы

• Это дополнительное расходование биомассы происходит не только в такой искусственной ситуации, но и в течение всего процесса. Просто эти расходы обычно «приписывают» к расходам на рост и образование продукта.

ПОДДЕРЖАНИЕ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ - 3

• Правильнее выделить эту статью расхода в отдельный член уравнения – на поддержание жизнедеятельности микроорганизмов Q₃

• Очевидно, что эти затраты пропорциональны концентрации микроорганизмов X: Q₃ = X*m_S

• Здесь m_S – коэффициент поддержания жизнедеятельности или УДЕЛЬНАЯ скорость расходования субстрата на поддержание жизнедеятельности микроорганизмов [г субстрата / г биомассы в час]

ИТОГОВОЕ УРАВНЕНИЕ КИНЕТИКИ ПОТРЕБЛЕНИЯ СУБСТРАТА

• Подставляя найденные зависимости, получаем уравнение

• Q_S = (-dS / dt) = (1 /Y_XS )Q_X + (1 /Y_PS ) Q_P + m_SX

• В этом уравнении коэффициенты Y_XS и Y_PS соответствуют стехиометрическим и не «приписывают» себе затраты субстрата на другие компоненты процесса

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ M_S

• Если пренебречь затратами на биосинтез продукта Q_P:

• Q_S= Q_X(1/Y_XS) + m_SX

• или q_S= (1/Y_XS) +m_S

• Графическое выражение зависимости представлено на графике q_S()

• В точке пересечения прямой с осью ординат ( = 0) имеем q_S= m_S

• А с осью абсцисс (q_S= 0)

•  = Y_XS*m_S

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЭФФИЦИЕНТОВ УРАВНЕНИЯ

• Находят по экспериментальным данным за определённый промежуток времени Δt четыре сопряжённых величины – приращения концентраций субстрата ΔS, биомассы ΔX, продукта ΔP и среднюю концентрацию биомассы за этот промежуток времени X

• Для этой совокупности данных строят уравнение:

• (ΔS/Δt) = (1/Y_XS)(ΔX/Δt) + (1/Y_PS)(ΔP/Δt) +X*m_S

• В этом уравнении 3 неизвестных коэффициента

• По другим экспериментальным данным строят дополнительные уравнения, и искомые коэффициенты находят методом наименьших квадратов

ВАРИАНТЫ УРАВНЕНИЙ ДЛЯ M_S

• m_S = 0 - (нет затрат на поддержание –характерно для конструктивных субстратов)

• m_S = m - (величина постоянна)

• m_S = KS - (затраты возрастают с повышением концентрации субстрата)

• m_S = m /(1 +S / K_i ) – (затраты возрастают при малых S)

СИСТЕМНАЯ МОДЕЛЬ ПРОЦЕССА ФЕРМЕНТАЦИИ

• Модель процесса включает описание динамики изменения в ходе процесса трёх основных параметров: концентрации биомассы X, субстрата S, и продукта метаболизма P.

• Система уравнений модели в общем виде:

КОНКРЕТИЗАЦИЯ МОДЕЛИ ПРОЦЕССА

• Системная модель включает 5 кинетических переменных , каждая из которых может быть описана одним из вариантов уравнений (элементарных) для этой переменной

• Выбор вида уравнений и определение коэффициентов в них проводится с помощью специальных экспериментов на реальном объекте