Лабораторная работа № 1.

Физиология растительной клетки

Все важнейшие проявления жизнедеятельности клетки связаны с мембранами. Одним из наиболее общих, неспецифических и быстрых ответов растительного организма на воздействие различных факторов внешней среды является изменение проницаемости клеточных мембран.

Опыт 1. Сравнение проницаемости мембран живых и мертвых клеток

Цель опыта: пронаблюдать за проницаемостью клеточного сока в живых и поврежденных клетках.

Материалы и оборудование: пробирки – 5 шт., спиртовка, спички, 30%-ный раствор уксусной кислоты, 50%-ный раствор этилового спирта, хлороформ, ФЭК, кюветы.

Растения: корнеплод столовой свеклы.

Удобным объектом для наблюдения служат ткани растений, клетки которых содержат в вакуолях красящие вещества, например, бетацианин. Этот пигмент находится в клеточном соке, хорошо растворим в воде и его молекула имеет достаточно большие размеры (М=564). Чтобы попасть во внешнюю среду, молекула бетацианина должна пройти через тонопласт, основной цитоплазматический матрикс и плазмалемму. Диффузия бетацианина из вакуоли в среду может проходить достаточно быстро при действии различных факторов или агентов, вызывающих изменение проницаемости мембран.

Ход работы: нарезать соломкой корнеплод красной свеклы. Для удаления содержимого поврежденных клеток полоски промыть в проточной воде.

В пять пробирок поместить предварительно нарезанные и отмытые в воде полоски корнеплода красной свеклы длиной 1,5–2 см и залить растворами согласно схеме опыта, приведенной в табл. 1. Кусочки должны быть полностью погружены в растворы.

Содержимое второй пробирки вскипятить, третьей – сильно встряхнуть для перемешивания наркотика (хлороформа) с водой. Через 30 мин определить оптическую плотность полученных растворов за сине-зеленым светофильтром (490 нм), полученные значения занести в рабочую тетрадь, в табл. 1, в качестве показателя «Степень окраски раствора».

Задание: выявите различия в проницаемости мембран живых и мертвых клеток. Распределите номера пробирок по нарастанию степени окраски. Проанализируйте полученные результаты, исходя из условий проведения эксперимента, и запишите вывод о проницаемости живой, наркотизированной или мертвой протоплазмы для клеточного сока.

Таблица 1

Схема записи опыта

№ пробирки	1.	2.	3.	4.	5.
Вариант опыта	Водопроводная вода	Водопроводная вода (кипячение)	Водопроводная вода + несколько капель хлороформа	30%-ный раствор уксусной кислоты	50%-ный раствор этилового спирта
Степень окраски раствора

Опыт 2. Обнаружение тонопласта (по де Фризу)

Цель опыта: показать различие свойств плазмалеммы и тонопласта.

Материалы и оборудование: микроскоп, предметные и покровные стекла, скальпель или нож, пинцет, препаровальная игла, фильтровальная бумага, 10% раствор KNO₃ с эозином.

Растения: бесцветный лук (Allium cepa).

Ход работы:

Эпидермис вогнутой (морфологически верхней) стороны чешуи бесцветного лука помещают на предметном стекле в каплю 1М (10%) раствора KNO₃ с эозином. Через 3-5 мину начинают наблюдения под микроскопом. Хорошо заметно уменьшение объема вауколи. Вначале протоплазма окружает вакуоль тонким слоем, но очень быстро начинается набухание протоплазмы, а затем отмирание протоплазмы и ядра, вызванные совместным действием KNO₃ и эозина, которые проникли в мезоплазму. Участки отмершей протоплазмы, окрашенные в ярко-розовый цвет хорошо заметны. В течение длительного времени вакуоль остается сократившейся, но не окрашенной в розовый цвет. Следовательно, ни KNO₃, ни эозин не проникают через тонопласт в вакуоль.

Задание: зарисовать наблюдаемые картины и сделать выводы.

Опыт 3. Прижизненное окрашивание клеток нейтральным красным

Цель опыта: ознакомиться с методом определения проницаемости цитоплазмы.

Материалы и оборудование: 0,02%-й раствор нейтрального красного в капельнице; 1М раствор КNO₃ в капельнице; скальпель; лезвие бритвы; препаровальная игла; микроскоп; предметные и покровные стекла; стеклянная палочка; стаканчик с водичкой; кусочки фильтрованной бумаги; цветные карандаши.

Растения: луковица обыкновенного лука, листья разных растений.

Краска нейтральный красный способна проникать в живые клетки и накапливаться в них в больших количествах. При непродолжительном пребывании клеток в растворе нейтрального красного цитоплазма не отмирает, в чем можно убедиться, вызвав плазмолиз окрашенных клеток (плазмолизироваться могут только живые клетки). Нейтральный красный – двухцветный индикатор: в кислой среде (рН < 6) он имеет малиновую окраску, в щелочной – желтую.

Для понимая результатов данной работы, необходимо иметь в виду, что в растворе рН около 7 нейтральный красный находится в форме недиссоциированных молекул, хорошо растворимых в липидах мембран, тогда как в кислой среде (рН < 6) это вещество диссоциирует на ионы, плохо растворимые в липидах.

Ход работы. Приготовить 2–3 среза эпидермиса чешуи обыкновенного лука или листьев каких либо других растений и поместить их на предметное стекло в большую каплю раствора нейтрального красного, не накрывая покровным стеклом (при хорошем доступе воздуха окрашивание происходит быстрее). Через 10–15 мин (не более) отсосать раствор краски фильтрованной бумагой, перенести срезы в каплю воды, накрыть покровным стеклом и рассмотреть в микроскоп. Заменить воду 1М раствором KNO₃ и продолжать наблюдение при большом увеличении.

Задание: зарисовать плазмолизированную клетку, отметив, какая часть окрашена красителем (клеточная стенка, цитоплазма или вакуоль) и в какой цвет (раскрасить цветным карандашом).

Лабораторная работа № 2. Физиология растительной клетки

Одним из способов изучения проницаемости мембран является прижизненное окрашивание, т. е. проникновение красителя из наружной среды во внутренние области живой клетки и постепенное их окрашивание. Катионные (основные) красители (нейтральный красный или метиленовый синий) проникают в живую клетку в молекулярной форме и проходят через плазмалемму, основной цитоплазматический матрикс, тонопласт в вакуоль, где они под влиянием кислой среды переходят в ионную форму. Поскольку мембраны не пропускают ионы красителя, они накапливаются в вакуоли и окрашивают её.

Клетки могут оставаться живыми в окрашенном состоянии в течение нескольких часов или дней. В мертвых клетках мембраны легкопроницаемы для любой формы красителя, поэтому в вакуоли не происходит его накопления.

Об избирательности проницаемости мембран свидетельствует также плазмолиз (рис. 1). В гипертоническом растворе вода выходит из клетки, вакуоль сокращается в результате потери воды, цитоплазма отстает от жесткой клеточной стенки и сжимается вслед за вакуолью. Однако если плазмалемма и тонопласт проницаемы для плазмолитика, то через некоторое время он проникает в вакуоль и происходит деплазмолиз. Скорость деплазмолиза зависит от проницаемости мембран для данного вещества, поэтому её можно использовать для определения проницаемости мембраны.

Рис. 1. Степени плазмолиза: а – цитоплазма; б – вакуоль; 1 – уголковый; 2 – вогнутый; 3 – выпуклый; 4 – судорожный; 5 – колпачковый