3.3.3. Контрольные вопросы к экзамену.
Модуль I. Введение в метаболизм
Химическая природа, физико-химические свойства и биологическая роль ферментов. Определение понятия: кофактор, холофермент, апофермент, кофермент, субстрат, продукт.
Ферменты - это белки, которые действуют как катализаторы в биологических системах.
Являясь веществами белкой природы, ферменты обладают всеми свойствами белков:
1. гидролизуются до аминокислот;
2. дают положительные цветные реакции на белки (биуретовую, ксантопротеиновую);
3. подобно белкам растворяются в воде с образованием коллоидных растворов;
4. являются амфотерными соединениями;
5. склонны к денатурации под влиянием тех же факторов: температуры, изменениях рН, действием солей тяжелых металлов, действием физических факторов (ультразвук, ионизирующее излучение и др.);
6. имеют несколько уровней организации макромолекул, что подтверждено данными рентгеноструктурного анализа, ЯМР, ЭПР.
Биологическая роль ферментов заключается в том, что они обеспечивают контролируемое протекание всех метаболических процессов в организме.
Кофактор – доп компонент небелковой природы, необходимый для работы фермента. Апофермент – белковая часть фермента, а каталитически активную форму сложного белка – холоферментом. (Хф = Кф + Аф). Коферменты – это органические вещества небелковой природы, принимающие участие в катализе в составе каталитического участка активного центра. Субстрат –вещество вступившее в реакции, а вещество выходящее – продукт.
Строение ферментов - простых, сложных, изоферментов: активный и аллостерический центры, роль в катализе.
Ферменты характеризуются наличием специфических центров катализа.
Активный центр – это часть молекулы фермента, которая специфически взаимодействует с субстратом и принимает непосредственное участие в катализе. В Ац можно выделить два участка: участок связывания субстрата – субстратный участок (контактная площадка) и собственно каталитический центр.
Большинство субстратов образует, по меньшей мере, три связи с ферментом, благодаря чему молекула субстрата присоединяется к активному центру единственно возможным способом, что обеспечивает субстратную специфичность фермента. Каталитический центр обеспечивает выбор пути химического превращения и каталитическую специфичность фермента.
У группы регуляторных ферментов есть аллостерические центры, которые находятся за пределами активного центра. К аллостерическому центру могут присоединяться “+” или “–“ модуляторы, регулирующие активность ферментов.
Различают ферменты простые, состоят только из аминокислот, и сложные, включают также низкомолекулярные органические соединения небелковой природы (коферменты) и (или) ионы металлов (кофакторы).
Механизм действия ферментов: теории Фишера, Кошланда. Стадии ферментативного катализа. Понятие о фермент-субстратном комплексе.
Э. Фишер предположил, что специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата («ключ-замок»).
Д. Кошланд («рука-перчатка»). В отличие от модели «ключ-замок», модель индуцированного соответствия объясняет не только специфичность ферментов, но и стабилизацию переходного состояния.
I. Активация фермента;
II. Узнавание ферментом своего субстрата;
III. Образование неактивного фермент-субстратного комплекса с помощью слабых водородных связей между субстратом и аминокислотами контактных участков;
IV. Образование активного фермент-субстратного комплекса за счет каталитического участка;
V. Образование продуктов реакции.
Фермент-субстратный комплекс – присоединение субстрата к активному центру фермента.
Кинетика ферментативных реакций (влияние на активность ферментов температуры, рН, концентрации фермента, концентрации субстрата).
Кинетика ферментативных реакций - раздел энзимологии изучающий влияние химических и физических факторов на скорость ферментативной реакции.
Скорость ферментативной реакции зависит температуры, реакции среды, концентрации реагирующих веществ, количества фермента и других факторов.
Зависимость от t0: при повышении T0 на каждые 100С скорость увеличивается примерно вдвое. После 50-600С ускоряется денатурация фермента – уменьшение скорости реакции.
Зависимость от pH:изменение рН приводит к изменению степени ионизазии изогенных групп в активном центре, а это влияет на сродство субстрата к активному центру и на каталитический механизм.
Зависимость от концентрации F: при избыточном количестве фермента прирост скорости реакции будет снижаться, поскольку уже не будет хватать субстрата.
Зависимость от концентрации S: при избыточном количестве субстрата прирост скорости реакции будет снижаться, поскольку не будет хватать фермента.
Ингибиторы ферментов. Использование ингибиторов ферментов в медицине.
Действие ферментов можно полностью или частично. По характеру действия ингибиторы могут быть обратимыми и необратимыми. В основе этого деления лежит прочность соединения ингибитора с ферментом. Другой способ деления ингибиторов основывается на характере места их связывания. Одни из них связываются с ферментом в активном центре, а другие — в удаленном от активного центра месте. Они могут связывать и блокировать функциональную группу молекулы фермента, необходимую для проявления его активности.
Терапевтическое действие аспирина как жаропонижающего и противовоспалительного средства объясняется тем, что аспирин ингибирует один из ферментов, катализирующий синтез простагландинов. Простагландины — вещества, участвующие в развитии воспаления. Ингибирование обусловлено ковалентной модификацией одной из аминогрупп фермента — простагландинсинтетазы.
Диизопропилфторфосфат ингибирует ферменты, имеющие серин в активном центре, таким ферментом является Ацетилхолинэстераза, катализирующая реакцию разложения ацетилхолина на ацетат и холин. Диизопропилфторфосфат — одно из отравляющих веществ нервно—паралитического действия, так как приводит к утрате способности нейронов проводить нервные импульсы.
Регуляция активности ферментов: аллостерическая, частичный протеолиз.
Аллостерическими ферментами называют ферменты, активность которых регулируется обратимым нековалентным присоединением модулятора (активатора и ингибитора) к специальному аллостерическому центру. Аллостерические ферменты являются олигомерными белками или имеют доменное строение. Эти ферменты играют важную роль в регуляции т.к. чрезвычайно быстро реагируют на изменения среды. Ингибиторами аллостерических ферментов часто являются конечные продукты метаболических путей, активаторами – их начальные субстраты. Активирование происходит по принципу прямой положительной связи, а ингибирование - по принципу отрицательной обратной связи.
Например, конечный продукт катаболизма глюкозы АТФ ингибирует аллостерически ферменты гликолиза фосфофруктокиназу и пируваткиназу. Накапливаемая в гликолизе фруктоза-1,6-ф активирует пируваткиназу, что ускоряет реакции гликолиза.
При участии активаторов и протеолитических ферментов происходит отщепление части молекулы фермента и его необратимая активация. Эти ферменты функционируют мало, а затем разрушаются. Характерно для внеклеточных ферментов ЖКТ (пепсин, трипсин, химотрипсин и др.) и ферментов свертывания крови (тромбин, фибрин, плазмин др.). Например, трипсиноген, синтезируемый в поджелудочной железе, поступает в двенадцатиперстную кишку, где энтеропептидаза кишечника отщепляет у него с N-конца гексапептид. В результате в оставшейся части молекулы фермента формируется активный центр.
Регуляция активности ферментов: фосфорилирование-дефосфорилирование, регуляция белковыми ингибиторами
Фосфорилирование осуществляется протеинкиназами, а дефосфорилирование – фосфопротеинфосфатазами. Введение отрицательно заряженной фосфорной группы приводит к обратимому изменению конформации и активности фермента. Например, под действием глюкагона в клетках происходит уменьшение синтеза жира, глико-гена и усиление его распада, вызванного фосфорилированием ключевых ферментов этих про-цессов. А под действием инсулина, наоборот, активируется синтез гликогена и ингибируется его распад, так как инсулин вызывает дефосфорилирование тех же ключевых ферментов.
Классификация и номенклатура ферментов. Локализация и компартментализация ферментов в клетке и тканях. Органоспецифические ферменты.
Номенклатура – названия индивидуальных соединений, их групп, классов, а также правила составления этих названий. Номенклатура ферментов бывает тривиальной (короткое рабочее название) и систематической. По систематической номенклатуре можно точно идентифицировать фермент и его катализируемую реакцию.
1. Классификация ферментов осуществляется по типу катализируемой реакции и ее меха-низму;
2. Реакции и ферменты, которые их катализируют, подразделяют на 6 классов, в каждом из которых несколько подклассов (4-13);
3. Название фермента состоит из 2 частей. 1 часть – название субстрата (субстратов). 2 часть – тип катализируемой реакции. Окончание – АЗА;
4. Дополнительная информация, если необходима, пишется в конце и заключается в скобки;
5. По классификации ферментов каждый фермент имеет свой шифр КФ 1.1.1.1. Первая цифра обозначает класс, вторая - подкласс, третья - подподкласс, четвертая - порядковый номер фермента в его подподклассе.
Ферменты по локализации делят на 3 группы:
Общие ферменты обнаруживаются практически во всех клетках, обеспечивают жизнедеятельность клетки, катализируя реакции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот, образование биомембран и основных клеточных органелл, энергообмен. Общие ферменты разных тканей и органов, тем не менее, отличаются по активности.
Органоспецифичные ферменты свойственны только определенному органу или ткани. Например: Для печени – аргиназа. Для почек и костной ткани – щелочная фосфатаза. Для предстательной железы – КФ (кислая фосфатаза). Внутри клеток ферменты также распределены неравномерно.
Органеллоспецифические ферменты. Разным органеллам присущ специфический набор ферментов, который определяет их функции.
Использование ферментов в медицине (Энзимодиагностика, энзимотерапия).
Медицинская энзимология – это раздел биохимии, изучающий применение ферментов в медицине. В области медицинской энзимологии выделяют три основных направления исследований: энзимопатология, энзимодиагностика и энзимотерапия.
Энзимодиагностика заключается в постановке диагноза заболевания или синдрома на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека. Принципы энзимодиагностики основаны на следующих позициях:
1) при повреждении клеток в крови или других биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается концентрация внутриклеточных ферментов повреждённых клеток;
2) количество высвобождаемого фермента достаточно для его обнаружения;
3) активность ферментов в биологических жидкостях, обнаруживаемых при повреждении клеток, стабильна в течение достаточно длительного времени и отличается от нормальных значений;
4) ряд ферментов имеет преимущественную или абсолютную локализацию в определённых органах (органоспецифичность);
5) существуют различия во внутриклеточной локализации ряда ферментов.
Системная энзимотерапия – использование полиферментных препаратов широкого спектра действия. Полиферментные препараты представляют собой эффективное противовоспалительное, противоотечное, фибринолитическое, иммуномодулирующее и вторично анальгетическое средство широкого спектра показаний. Препараты вобэнзим, вобэмугос, флогэнзим применяются в области травматологии, хирургии, спортивной медицины, ревматологии, ангиологии и гинекологии.
Энзимопатология. Понятие о первичных и вторичных энзимопатиях.
Энзимопатология – это частная медицинская энзимология, которая изучает молекулярные основы развития патологического процесса, вызванного нарушением механизмов регуляции активности или синтеза ферментов.
Энзимопатии – это группа заболеваний, которые вызваны различными дефектами ферментов. Энзимопатий делятся на: наследственные (первичные) и приобретенные (вторичные). Приобретенные энзимопатии делятся на алиментарные, токсические и вызванные различными патологическими состояниями организма, например нарушениями КОС, повышением температуры тела и т.д.
Причиной наследственных энзимопатий является генетически обусловленная недостаточность или полное отсутствие синтеза ферментов.
Аллиментарные энзимопатии – это стойкие нарушения активности ферментов, связанные с характером питания:
1. отсутствием или снижением в пище количества белка;
2. дефицитом в пище витаминов, макро- и микроэлементов, некоторых низкомолекулярных биологически активных веществ;
3. нарушением соотношения в пище белков, жиров и углеводов;
Токсические энзимопатии обусловлены избирательным угнетением активности или синтеза отдельных ферментов или неспецифическим угнетением биосинтеза белка в результате длительного воздействия токсических агентов. Токсическим агентами являются соли тяжелых металлов.
О
сновные
этапы катаболизма пищевых веществ и
образования субстратов для биологического
окисления. Общий путь катаболизма, его
роль в метаболизме.
Катаболизм – процесс расщепления сложных молекул до более простых, идущий с выделением энергии.
Все катаболические процессы можно разделить на 3 этапа (фазы)
В I фазе происходит распад полимерных молекул на мономеры (белки до А/К и тд). Эта фаза локализуется в ЖКТ это так называемый распад экзогенных полимеров и распад эндогенных полимеров локализующихся в клетках т. е. распад резервных углеводов, липидов, обновление белков В этой фазе происходит резкое уменьшение числа соединений, которые затем вступают во II фазу катаболизма.
Во II фазе эти соединения подвергаются дальнейшему - расщеплению и на входе из этой фазы остается в основном 5 соединекий (Ацетил-КоА, (ЩУК, Пировинограт,) Оксалоацетат Фумарат, 2-оксоглуторкг, сукцинил-КоА). Благодаря окислительным процессам и другим процессам, на этой стадии выделяется 1/3 часть энергии заключенной в питательных веществах
В III фазе все 5 соединений вступают в Цикл Кребса, в котором они и расщепляются до конечных продуктов, а из Цикла Кребса выходят атомы водорода, которые проходя через цепь дыхательных ферментов соединяются с кислородом с образованием воды. Эта фаза носит исключительно окислительный характер В ней выделяется 2/3 энергии питат. вещ-в и аккумуляция энергии достигает 40% Смысл катаболических процессов состоит в том, что по мере углубления распада питательных веществ, количество промежуточных продуктов уменьшается.
Общий путь катаболизма – конечный путь окисления ацетильных групп в которые в процессе катаболизма превращается большинство органических молекул, играющих роль клеточного топлива. Он выполняет интегративную (объединяет катаболические пути углеводов, липидов и белков); амфиболическую (выполняет как катаболическую, та и анаболическую функции); энергетическую (синтез АТФ); водорододонорную (генератор Н+ для дыхательной цепи) функции.
Макроэргические вещества. АТФ как основное макроэргическое соединение клетки. Цикл АТФ-АДФ. Понятие о субстратном и окислительном фосфорилировании.
Макроэргические вещества – биологически активные соединения, накапливающие большое количество энергии, освобождение которой при расщеплении макроэргических связей обеспечивает энергетические нужды клетки. К ним относятся АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ, креатинфосфат.
АТФ - молекула, богатая энергией, поскольку она содержит две фосфоангидридные связи (β, γ). При гидролизе концевой фосфоангидридной связи АТФ превращается в АДФ и ортофосфат. Цикл АТФ-АДФ - основной механизм обмена энергии в биологических системах.
Субстратное фосфорилирование - фосфорилирование АДФ и образование АТФ, сопряженное с дегидрированием и предварительным фосфорилированием субстрата при его окислении, протекающее в условиях кислородной недостаточности.
Окислительное фосфорилирование - фосфорилирование АДФ, сопряженное с переносом электронов от субстрата к кислороду и аккумуляцией освободившейся энергии в фосфатных связях АТФ.
Пируватдегидрогеназный комплекс: структура, функция, коферменты. Связь с обменом витаминов. Превращение пирувата в АцКоА. Связь процесса с циклом Кребса и тканевым дыханием.
Пируватдегидрогеназный комплекс (ПДК) — комплекс трех ферментов, который осуществляет окислительное декарбоксилирование пирувата. Продуктами окисления являются Со2, ацетил-КоА, НАДН.Н+.
Превращение состоит из 5-и последовательных реакций, осуществляется мультиферментным комплексом, прикрепленным к внутренней митохондриальной мембране со стороны матрикса. В составе комплекса насчитывают 3 фермента и 5 коферментов:
1) пируватдегидрогеназа, ее коферментом является тиаминдифосфат, катализирует 1-ю реакцию;
2) Дигидролипоат-ацетилтрансфераза, ее коферментом является липоевая кислота, катализирует 2-ю и 3-ю реакции;
3) Дегидролипоат-дегидрогеназа, ее кофермент – ФАД, катализирует 4-ю и 5-и реакции. Также принимают участие коэнзим А и НАД.
Суть первых 3-х реакций сводится к декарбоксилированию пирувата (катализируется пируватдегидрогеназой) окислению пирувата до ацетила и переносу ацетила на коэнзим А. Оставшиеся 2 реакции необходимы для возвращения липоевой кислоты и ФАД в окислительное состояние, при этом образуется НАДН
Цикл Кребса, как общий (универсальный) этап утилизации белков, жиров и углеводов и образования субстратов тканевого дыхания. Энергетический баланс одного оборота. Регуляция ЦТК. Реакции взаимосвязи ЦТК с гликолизом и окислительным фосфорилированием.
Цикл Кребса — это ключевой этап дыхания всех клеток, использующих кислород, центр пересечения множества метаболических путей в организме. Кроме значительной энергетической роли циклу отводится также и существенная пластическая функция, то есть это важный источник молекул-предшественников, из которых в ходе других биохимических превращений синтезируются такие важные для жизнедеятельности клетки соединения как аминокислоты, углеводы, жирные кислоты и др.
Цикл: Пируват (Пируват дегидрогеназа)→ Ацетил-КоА + ЩУК (цитрат-синтаза)→ Цитрат (аконитат-гидратаза)↔ цис-Аконитат (аконитат-гидратаза)↔ Изоцитрат (изоцитратдегидрогеназа)→ α-Кетоглутарат (α-Кетоглутарат-дегидрогиназный комплекс)→ Сукцинил-КоА (сукцинил-КоА-синтетаза)→ Сукцинат (сукцинат-дегидрогеназа)→ Фумарат (фумараза)→ L-малат (малатдегидрогеназа)→ ЩУК (цитрат-синтаза)…
Таким образом, за один оборот цикла происходит полное окисление одной молекулы ацетил-КоА с образованием 12 молекул АТФ. Образуется 3 НАДН2, 1 ФАДН2 и ГТФ. Каждая молекула НАДН2 дает в системе тканевого дыхания 3 молекулы АТФ, ФАДН2 – 2 молекулы АТФ и ГТФ – 1 молекулу АТФ. 3*3АТФ + 2АТФ + 1АТФ = 12АТФ
Цикл Кребса регулируется «по механизму отрицательной обратной связи», при наличии большого количества субстратов (ацетил-КоА, оксалоацетат), цикл активно работает, а при избытке продуктов реакции (NADH, ATP) тормозится. Регуляция осуществляется и при помощи гормонов, основным источником ацетил-КоА является глюкоза, поэтому гормоны, способствующие аэробному распаду глюкозы, способствуют работе цикла Кребса. Такими гормонами являются: инсулин и адреналин. Глюкагон стимулирует синтез глюкозы и ингибирует реакции цикла Кребса.
Посредством аэробного гликолиза глюкоза распадается до пирувата, который включается в ЦТК. В цикле путем окислительного фосфорилирования синтезируется 1 ГТФ, а затем из него синтезируется АТФ посредствам трансфосфорилирования: ГТФ + АДФ = АТФ + ГДФ.
Состав, структура ферментативных комплексов и других компонентов дыхательной цепи, их локализация и функции во внутренней мембране митохондрий. Роль кислорода. Каскадные изменения свободной энергии при переносе электронов по дыхательной цепи.
Цепь переноса электронов позволяет запасти энергию, выделяющуюся в ходе окисления НАД∙Н и ФАДН2 молекулярным кислородом в форме трансмембранного протонного потенциала за счёт последовательного переноса электрона по цепи, сопряжённого с перекачкой протонов через мембрану. Протонный потенциал преобразуется АТФ-синтазой в энергию химических связей АТФ. Сопряжённая работа ЭТЦ и АТФ-синтазы носит название окислительного фосфорилирования.
Комплекс I (НАДН дегидрогеназа) окисляет НАД-Н, отбирая у него два электрона и перенося их на растворимый в липидах убихинон, который внутри мембраны диффундирует к комплексу III. Вместе с этим, комплекс I перекачивает 4 протона из матрикса в межмембранное пространство митохондрии.
Комплекс II (Сукцинат дегидрогеназа) не перекачивает протоны, но обеспечивает вход в цепь дополнительных электронов за счёт окисления сукцината.
Комплекс III (Цитохром bc1 комплекс) переносит электроны с убихинона на два водорастворимых цитохрома с, расположенных на внутренней мембране митохондрии. Убихинон передаёт 2 электрона, а цитохромы за один цикл переносят по одному электрону. При этом туда также переходят 2 протона убихинона и перекачиваются комплексом.
Комплекс IV (Цитохром c оксидаза) катализирует перенос 4 электронов с 4 молекул цитохрома на O2 и перекачивает при этом 4 протона в межмембранное пространство. Комплекс состоит из цитохромов a и a3, которые, помимо гема, содержат ионы меди.
Кислород, поступающий в митохондрии из крови, связывается с атомом железа в геме цитохрома a3 в форме молекулы O2. Каждый из атомов кислорода присоединяет по два электрона и два протона и превращается в молекулу воды.
Механизм сопряжения окисления и фосфорилирования. Коэффициент Р/0. Хемиосмотическая теория Митчелла. Дыхательный контроль как основной механизм регуляции сопряжения окисления и фосфорилирования.
1.Протонный градиент и электрохимический потенциал. Перенос электронов по дыхательной цепи от NADH к кислороду сопровождается выкачиванием протонов из матрикса митохондрий через внутреннюю мембрану в межмембранное пространство. На эту работу затрачивается часть энергии электронов, переносимых по ЦПЭ. Протоны, перенесённые из матрикса в межмембранное пространство, не могут вернуться обратно в матрикс, так как внутренняя мембрана непроницаема для протонов. Таким образом, создаётся протонный градиент, при котором концентрация протонов в межмембранном пространстве больше, а рН меньше, чем в матриксе. Кроме того, каждый протон несёт положительный заряд, и вследствие этого появляется разность потенциалов по обе стороны мембраны: отрицательный заряд на внутренней стороне и положительный - на внешней. В совокупности электрический и концентрационный градиенты составляют электрохимический потенциал ΔμН+ - источник энергии для синтеза АТФ. Так как наиболее активный транспорт протонов в межмембранное пространство, необходимый для образования ΔμН+, происходит на участках ЦПЭ, соответствующих расположению комплексов I, III и IV, эти участки называют пунктами сопряжения дыхания и фосфорилирования. KoQ переносит электроны от комплекса I к комплексу III и протоны из матрикса в межмембранное пространство, совершая своеобразные циклические превращения, называемые Q-циклами. Донором электронов для комплекса III служит восстановленный убихинон (QH2), а акцептором - цитохром с. Цитохром с находится с внешней стороны внутренней мембраны митохондрий; там же располагается активный центр цитохрома с1 с которого электроны переносятся на цитохром с. Сопряжение переноса электронов через дыхательный комплекс III с транспортом Н+ через мембрану. Восстановленный убихинон (QH2) взаимодействует с Fе3+ гема b1 и, восстанавливая его, освобождает протон в водную фазу, превращаясь в семихинон (НQ•). Электрон от тема b1 переносится на Fe3+ тема b2. HQ• отдаёт второй электрон на FeS-центр, расположенный ближе к наружной поверхности мембраны; при этом второй протон оказывается в межмембранном пространстве; электрон передаётся на цитохром с1, а далее на цитохром с. Окисленный Q диффундирует к внутренней стороне мембраны, где получает электрон от тема b2 и протон из матрикса, превращаясь в НQ•. НQ• получает электрон от комплекса I и протон из матрикса; в мембране образуется QН2, и весь процесс повторяется сначала. В мембране существует стационарный общий фонд Q/QH2, из которого каждая молекула QH2 в одном цикле обеспечивает перенос протонов из матрикса в межмембранное пространство и электронов, которые в конечном итоге поступают на кислород. На работу, совершаемую при выкачивании протонов, расходуется часть свободной энергии, которая освобождается при переносе электронов по градиенту редокс-потенциала. Энергия электрохимического потенциала (∆μH+) используется для синтеза АТФ, если протоны возвращаются в матрикс через ионные каналы АТФ-синтазы. 2. Строение АТФ-синтазы и синтез АТФ. АТФ-синтаза (Н+-АТФ-аза) - интегральный белок внутренней мембраны митохондрий. Он расположен в непосредственной близости к дыхательной цепи. АТФ-синтаза состоит из 2 белковых комплексов, обозначаемых как F0 и F1. Гидрофобный комплекс F0 погружён в мембрану. Он служит основанием, которое фиксирует АТФ-синтазу в мембране. Комплекс F0 состоит из нескольких субъединиц, образующих канал, по которому протоны переносятся в матрикс. Комплекс F1 выступает в митоховдриальный матрикс. Он состоит из 9 субъединиц (Зα, 3β, γ, ε, δ). Субъединицы аир уложены попарно, образуя "головку"; между α- и β-субъединицами располагаются 3 активных центра, в которых происходит синтез АТФ; γ-, ε-, δ- субъединицы связывают комплекс F1 с F0. Повышение концентрации протонов в межмембранном пространстве активирует АТФ-синтазу. Электрохимический потенциал ΔμH+ заставляет протоны двигаться по каналу АТФ-синтазы в матрикс. Параллельно под действием ΔμH+ происходят конформационные изменения в парах α, β-субъединиц белка F1, в результате чего из АДФ и неорганического фосфата образуется АТФ. Электрохимический потенциал, генерируемый в каждом из 3 пунктов сопряжения в ЦПЭ, используют для синтеза одной молекулы АТФ. 3.Коэффициент окислительного фосфорилирования. Окисление молекулы NADH в ЦПЭ сопровождается образованием 3 молекул АТФ; электроны от FAD-зависимых дегидрогеназ поступают в ЦПЭ на KoQ, минуя первый пункт сопряжения. Поэтому образуются только 2 молекулы АТФ. Отношение количества фосфорной кислоты (Р), использованной на фосфорилирование АДФ, к атому кислорода (О), поглощённого в процессе дыхания, называют коэффициентом окислительного фосфорилирования и обозначают Р/О. Следовательно, для NADH Р/О = 3, для сукцината Р/О - 2. Эти величины отражают теоретический максимум синтеза АТФ, фактически эта величина меньше. 4.Дыхательный контроль. Окисление субстратов и фосфорилирование АДФ в митохондриях прочно сопряжены. Скорость использования АТФ регулирует скорость потока электронов в ЦПЭ. Если АТФ не используется и его концентрация в клетках возрастает, то прекращается и поток электронов к кислороду. С другой стороны, расход АТФ и превращение его в АДФ увеличивает окисление субстратов и поглощение кислорода. Зависимость интенсивности дыхания митохондрий от концентрации АДФ называют дыхательным контролем. Механизм дыхательного контроля характеризуется высокой точностью и имеет важное значение, так как в результате его действия скорость синтеза АТФ соответствует потребностям клетки в энергии. Запасов АТФ в клетке не существует. Относительные концентрации АТФ/АДФ в тканях изменяются в узких пределах, в то время как потребление энергии клеткой, т.е. частота оборотов цикла АТФ и АДФ, может меняться в десятки раз.
Общее содержание АТФ в организме 30-50 г, но каждая молекула АТФ в клетке "живёт" меньше минуты. В сутки у человека синтезируется 40-60 кг АТФ и столько же распадается. Увеличение концентрации АДФ немедленно приводит к ускорению дыхания и фосфорилирования.
Механизмы разобщения окисления и фосфорилирования. Особенности функционирования бурой жировой ткани.
Некоторые химические вещества (протонофоры) могут переносить протоны или другие ионы (ионофоры) из межмембранного пространства через мембрану в матрикс, минуя протонные каналы АТФ-синтазы. В результате этого исчезает электрохимический потенциал и прекращается синтез АТФ. Это явление называют разобщением дыхания и фосфорилирования. В результате разобщения количество АТФ снижается, а АДФ увеличивается. В этом случае скорость окисления NADH и FADH2 возрастает, возрастает и количество поглощённого кислорода, но энергия выделяется в виде теплоты, и коэффициент Р/О резко снижается. Как правило, разобщители - липофильные вещества, легко проходящие через липидный слой мембраны. Одно из таких веществ - 2,4-динитрофенол, легко переходящий из ионизированной формы в неионизированную, присоединяя протон в межмембранном пространстве и перенося его в матрикс.
Примерами разобщителей могут быть также некоторые лекарства, например дикумарол - антикоагулянт или метаболиты, которые образуются в организме, билирубин - продукт катаболизма тема, тироксин - гормон щитовидной железы. Все эти вещества проявляют разобщающее действие только при их высокой концентрации.
Разобщение окислительного фосфорилирования может быть биологически полезным. Оно позволяет генерировать тепло для поддержания температуры тела у новорождённых, у зимнес-пящих животных и у всех млекопитающих в процессе адаптации к холоду. У новорождённых, а также зимнеспящих животных существует особая ткань, специализирующаяся на теплопродукции посредством разобщения дыхания и фосфорилирования - бурый жир. Бурый жир содержит много митохондрий. В мембране митохондрий имеется большой избыток дыхательных ферментов по сравнению с АТФ-синтазой. Около 10% всех белков приходится на так называемый разобщающий белок (РБ-1) - термогенин. Бурый жир имеется у новорождённых, но его практически нет у взрослого человека. В последние годы появились факты, свидетельствующие о существовании в митохондриях разных органов и тканей млекопитающих разобщающих белков, похожих по своей структуре на РБ-1 бурой жировой ткани. По своей структуре термогенин близок к АТФ/АДФ-антипортеру, но не способен к транспорту нуклеотидов, хотя сохранил способность переносить анионы жирных кислот, служащих разобщителями. На внешней стороне мембраны анион жирной кислоты присоединяет протон и в таком виде пересекает мембрану; на внутренней стороне мембраны диссоциирует, отдавая протон в матрикс и тем самым снижает протонный градиент. Образующийся анион возвращается на наружную сторону мембраны с помощью АТФ/ АДФ-антипортера. При охлаждении стимулируется освобождение норадреналина из окончаний симпатических нервов. В результате происходят активация липазы в жировой ткани и мобилизация жира из жировых депо. Образующиеся свободные жирные кислоты служат не только "топливом", но и важнейшим регулятором разобщения дыхания и фосфорилирования.
Моно- и диоксигеназные пути использования кислорода в клетке. Пероксидазный и радикальный пути использования кислорода.
Монооксигеназные реакции.
Живые организмы содержат группу многочисленных и разнообразных ферментов, получивших название монооксигеназ. В типичном случае один атом кислородной молекулы обнаруживается в новой гидроксидной группе субстрата, другой – восстанавливается до воды в процессе реакции. В соответствии с этим реакция должна протекать при участии фермента, субстрата, кислородаи какого-либо восстанавливающего агента. Допамин-b-монооксигеназа, присутствующая в мозге и в хромаффинной ткани, катализирует гидроксилирование 3,4-диоксифенилэтиламина до норадреналина. Фенолмонооксигеназы имеются у бактерий, растений, насекомых, а также в печени и коже млекопитающих. Полимеризация о-хинона, образовавшегося в результате цепочки реакции, катализируемых этими ферментами, лежит в основе образования меланина.
Диоксигеназные реакции.
Ферменты, катализирующие реакции, в которых оба атома молекулярного кислорода встраиваются в продукты реакции, называются диоксигеназами. Известные в настоящее время ферменты этой группы могут содержать в качестве активной группы гем или негемовое железо, а для действия некоторых необходим a-кетоглутарат. Железо-a-кетоглутаратдиоксигеназы – железозависимые ферменты, катализирующие гидроксилирование субстрата в ходе процесса, в котором a-кетоглутарат подвергается окислительному декарбоксилированию до сукцината: М + О2 + a-кетоглутарат М-ОН + сукцинат + СО2 Пероксидазный путь использования кислорода.Молекулярный кислород является парамагнитным, потому что он содержит два неспаренных электрона с параллельно ориентированными спинами. Эти электроны находятся на разных орбиталях , поскольку два электрона не могут занимать одну и ту же орбиталь, если только их спины не противоположны. Соответственно восстановление кислорода путем прямого введения пары электронов в его частично заполненные орбитали невозможно без «обращения» спина одного из двух электронов. Спиновой запрет восстановления может быть преодолен последовательным добавлением одиночных электронов. Полное восстановление О2 до 2Н2О требует 4 электрона; при одноэлектронном восстановлении в качестве промежуточных продуктов возникают супероксид, пероксид водорода и гидроксидный радикал. Эти продукты очень реакционноспособны, и их присутствие может представлять угрозу для целостности живых систем. На самом деле ОН – наиболее мутагенный продукт ионизирующей радиации – представляет собой чрезвычайно мощный окислитель, который может атаковать все органические соединения. Одноэлектронное восстановление кислорода инициирует цепь реакций, которые ведут к образованию ОН:
О2 + е ® О2 (1)
О2 + Н ®НО2 (2)
О2+ НО2 + Н ® Н2О2+О2 (3)
Супероксид-анион, образуемый в реакции (1), может протонироваться до гидропероксидного радикала (2). Реакция (3) представляет собой спонтанную дисмутацию, приводящую к образованию Н2О2+О2. Совокупность этих реакций дает основание предполагать, что любая система, продуцирующая О2, будет также вскоре содержать Н2О2. Ксантиноксидаза, альдегидоксидаза и многочисленные флавопротеиды образуют О2 и Н2О2, что происходит и при самопроизвольном окислении гемоглобина, ферредоксинов, восстановленных цитохромом b5 гидрохинонов, тетрагидроптеридинов и адреналина. Угроза для клеток, возникающая из-за реакционноспособности О2и Н2О2, устраняется действием ферментов, эффективно обезвреживающих эти соединения
Свободно-радикальный путь (идет без участия ферментов и АТФ не
образуется).
Реакции образования активных форм О2 (О2-, ֹОН, 1O2, О22-, R-ООֹ), значение в физиологии и патологии клетки. Механизмы свободно-радикального окисления молекул и антиоксидантной защиты.
Утечка электронов из ЦПЭ и непосредственное их взаимодействие с кислородом - основной путь образования АФК. Кофермент Q в превращается в семихинон – KoQH, который может образовывать супероксидный анион , который, в свою очередь, может превращаться в другие активные формы кислорода. Многие оксидазы(оксидазы аминокислот, супероксид дисмугаза, оксидазы, локализованные в пероксисомах) - ферменты, непосредственно восстанавливающие кислород, образуют пероксид водорода. Монооксигеназы и диоксигеназы тоже источники активных форм кислорода. Пероксид водорода способствует образованию наиболее токсичной формы кислорода - гидроксильного радикала (ОН). Наличие в клетках ионов переходных металлов увеличивает скорость образования АФК(окисление иона железа гемоглобина способствует образованию супероксидного аниона)
Активные формы кислорода повреждают структуру ДНК, белков и различные мембранные структуры клеток, за счёт образования гидропероксидов жирных кислот в клетки могут проникать вода, ионы натрия, кальция, что приводит к набуханию клеток, органелл и их разрушению. Активация перекисного окисления характерна для многих заболеваний: дистрофии мышц, болезни Паркинсона, при которых разрушаются нервные клетки в стволовой части мозга, при атеросклерозе, развитии опухолей.
К ферментам, защищающим клетки от действия активных форм кислорода, относят супе-роксиддисмутазу, каталазу и глутатионпероксидазу; Наиболее активны эти ферменты в печени, надпочечниках и почках, где содержание митохондрий, цитохрома Р450 и пероксисом особенно велико. Супероксиддисмутаза (СОД) превращает супероксидные анионы в пероксид водорода, который может инициировать образование самой активной формы ОН•, разрушается каталазой; глутатионпероксидаза - важнейший фермент, обеспечивающий инактивацию активных форм кислорода, так как он разрушает и пероксид водорода и гидропероксиды липидов. Он катализирует восстановление пероксидов с помощью трипептида глутатиона (γ-глутамилцистеинилглицин). Сульфгидрильная группа глутатиона (GSH) служит донором электронов и, окисляясь, образует дисульфидную форму глутатиона, в которой 2 молекулы глутатиона связаны через дисульфидную группу, окисленный глутатион восстанавливается глутатионредуктазой, 2О2• + 2H+ → H2O2 + O2; 2Н2О2 → 2 Н2О + О2.; Н2О2 + 2 GSH → 2 Н2О + G-S-S-G, GS-SG + NADPH + Н+ → 2 GSH + NADP+.
Модуль II: Метаболизм углеводов.