38. Репликация днк: механизм и биологическое значение. Повреждение днк, репарация повреждений и ошибок репликации днк.

Репликация (синтез) ДНК происходит не беспорядочно, а в строго определенный период жизни клетки. Всего выделяют 4 фазы клеточного цикла: митоз (М), синтетическую (S), пресинтетическую (G1, от англ. gap – интервал), постсинтетическую (G2). Важное участие в регуляции смены фаз клеточного цикла занимают циклины – белки массой 35-90 кДа, уровень которых меняется в ходе клеточного цикла. По функции циклины – это активаторные субъединицы ферментов циклин-зависимых киназ (ЦЗК). Активные комплексы циклин-ЦЗК фосфорилируют внутриклеточные белки, изменяя их активность. Этим обеспечивается продвижение по клеточному циклу. Синтез (репликация, удвоение) ДНК происходит в S-фазу клеточного цикла, когда клетка готовится к делению. Механизм репликации, как установили Мэтью Мезельсон и Франклин Сталь в 1957 г, полуконсервативный, т.е. на каждой нити материнской ДНК синтезируется дочерняя копия.

Как любой матричный биосинтез, репликация требует наличия нескольких компонентов:

матрица – в ее роли выступает материнская нить ДНК,

растущая цепь – дочерняя нить ДНК,

субстраты для синтеза – dАТФ, dГТФ, dЦТФ, ТТФ,

источник энергии – dАТФ, dГТФ, dЦТФ, ТТФ,

ферменты.

Синтез ДНК начинается в определенных участках, получивших название точка ori (англ. origin – начало). На каждой ДНК млекопитающих точек ori насчитывается до 100. Репликация распространяется от этих участков в обе стороны по нитям ДНК с образованием репликативных "пузырей". В каждом таком "пузыре" имеются две репликативные "вилки", в которых происходит расплетание, раскручивание и непосредственный синтез ДНК. При этом репликативные вилки удаляются друг от друга. В целом репликация всех ДНК у эукариот заканчивается за 9 часов.

Синтез новой цепи ДНК идет в направлении от 5'-конца к 3'-концу, т.е. 5'-конец новой ДНК остается свободным, следующие нуклеотиды присоединяются к 3'-гидроксильной группе предыдущего нуклеотида со скоростью порядка 100 штук в секунду.

В репликативной вилке в направлении 5'→3' непрерывно (т.е. обычным заурядным присоединением последующих нуклеотидов к предыдущим через С3 и С5) синтезируется только одна нить, а именно та, для которой направление синтеза совпадает с направлением движения репликативной вилки и соответствует направлению материнской нити 3'→5'. По мере расплетания ДНК и движения репликативной вилки на этой материнской нити открываются участки, где возможно безостановочное удлинение ведущей дочерней нити. Направление 5'→3' для другой дочерней нити ДНК противоположно движению репликативной вилки. Поэтому синтез этой отстающей нити (в направлении 5'→3') возможен только после расплетания части ДНК и освобождения участка для синтеза. Т.о., синтез дочерней ДНК идет фрагментарно. По имени японского исследователя синтезируемые на отстающей цепи отрезки ДНК назвали фрагменты Оказаки.

В хронологическом порядке события репликации развертываются примерно следующим образом:

1.ДНК-топоизомеразы, находясь перед репликативной вилкой, разрезают молекулу ДНК для облегчения ее расплетания и раскручивания.

2. ДНК-хеликазы, следуя за топоизомеразами, раскручивают и расплетают молекулу ДНК.

3. ДНК-связывающие белки (ДСБ) связывают расплетенные нити ДНК и стабилизируют их, не допуская обратного "слипания" друг с другом.

4. ДНК-полимераза δ (греч.: δ – дельта), согласовано со скоростью движения репликативной вилки, осуществляет синтез ведущей цепи дочерней ДНК в направлении 5'→3' на матрице материнской нити ДНК по направлению от ее 3'-конца к 5'-концу (скорость до 100 пар нуклеотидов в секунду).Этим события на данной материнской нити ДНК ограничиваются.Далее описан синтез отстающей цепи дочерней ДНК.

5. Непосредственно сразу после расплетания и стабилизации другой нити материнской молекулы к ней присоединяется ДНК-полимераза α (α- альфа ) и в направлении 5'→3' синтезирует праймер (РНК-затравку) – последовательность РНК на матрице ДНК длиной от 10 до 200 нуклеотидов. После этого фермент удаляется с нити ДНК.Вместо ДНК-полимеразы α к 3'-концу праймера присоединяется ДНК-полимераза ε.

6. ДНК-полимераза ε (греч.: ε – эпсилон) как бы продолжает удлинять праймер, но в качестве субстрата встраивает дезоксирибонуклеотиды (в количестве 150-200 нуклеотидов). В результате образуется цельная нить из двух частей – РНК (т.е. праймер) и ДНК. ДНК-полимераза ε работает до тех пор, пока не встретит праймер предыдущего фрагмента Оказаки (синтезированный чуть ранее). После этого данный фермент удаляется с цепи.

7. ДНК-полимераза β (греч.: β – бета) встает вместо ДНК-полимеразы ε, движется в том же направлении (5'→3') и удаляет рибонуклеотиды праймера, одновременно встраивая дезоксирибонуклеотиды на их место. Фермент работает до полного удаления праймера, т.е. пока на его пути не встанет дезоксирибонуклеотид (еще более ранее синтезированный ДНК-полимеразой ε). Связать результат свой работы и впереди стоящую ДНК фермент не в состоянии, поэтому он сходит с цепи. В результате на матрице материнской нити "лежит" фрагмент дочерней ДНК. Он называется фрагмент Оказаки.

8. ДНК-лигаза производит сшивку двух соседних фрагментов Оказаки, т.е. 5'-конца отрезка, синтезированного ДНК-полимеразой ε, и 3'-конца цепи, встроенного ДНК-полимеразой β.

Повреждения и репарация ДНК. Так как на геном любой неделящейся клетки постоянно оказывает влияние окружающая среда, то вполне вероятны повреждения в составе нуклеотида, также возможно встраивание неправильного нуклеотида при репликации. Такие нарушения быстро определяются специальными ферментами, пораженный участок удаляется экзонуклеазами, заполняется ДНК-полимеразой β и сшивается ДНК-лигазой.

В случае изменения структуры основания (например, его дезаминирование) это основание удаляется ДНК-N-гликозидазой, затем другими ферментами удаляется дезоксирибоза и на ее место ДНК-полимеразой β и ДНК-лигазой встраивается нужный нуклеотид. Отрыв пуриновых и пиримидиновых оснований от дезоксирибозы устраняется ДНК-инсертазами, которые присоединяют к оставшейся дезоксирибозе соответствующие основания.

39. Типы РНК: особенности строения, размеры и разнообразие молекул, локализация в клетке, функции. Биосинтез РНК (транскрипция). Строение рибосом и полирибосом. Синтез аминоацил-тРНК. Субстратная специфичность аминоацил-тРНК-синтетаз.

Первичная структура РНК - порядок чередования рибонуклеозидмонофосфатов (НМФ) в полинуклеотидной цепи. В РНК, как и в ДНК, нук-леотиды связаны между собой 3',5'-фосфодиэфирными связями. Концы полинуклеотидных цепей РНК неодинаковы. На одном конце находится фосфорилированная ОН-группа 5'-углеродного атома, на другом конце - ОН-группа 3'-углеродного атома рибозы, поэтому концы называют 5'- и 3'-концами цепи РНК. Гидроксильная группа у 2'-углеродного атома рибозы делает молекулу РНК нестабильной. Так, в слабощелочной среде молекулы РНК гидролизуются даже при нормальной температуре, тогда как структура цепи ДНК не изменяется.

Вторичная структура РНК. Молекула рибонуклеиновой кислоты построена из одной полинуклеотидной цепи. Отдельные участки цепи РНК образуют спирализованные петли - "шпильки", за счёт водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями A-U и G-C. Участки цепи РНК в таких спиральных структурах антипараллельны, но не всегда полностью комплементарны, в них встречаются неспаренные нуклеотидные остатки или даже одноцепочечные петли, не вписьюающиеся в двойную спираль. Наличие спирализованных участков характерно для всех типов РНК.

Третичная структура РНК .Одноцепочечные РНК характеризуются компактной и упорядоченной третичной структурой, возникающей путём взаимодействия спирализованных элементов вторичной структуры. Так, возможно образование дополнительных водородных связей между нуклеотидными остатками, достаточно удалёнными друг от друга, или связей между ОН-группами остатков рибо-зы и основаниями. Третичная структура РНК стабилизирована ионами двухвалентных металлов, например ионами Mg2+, связывающимися не только с фосфатными группами, но и с основаниями.

Основные типы РНК: В цитоплазме клеток присутствуют 3 типа рибонуклеиновых кислот - транспортные РНК (тРНК), матричные РНК (мРНК) и рибосомальные РНК (рРНК). Они различаются по первичной структуре, молекулярной массе, конформации, продолжительности жизни и по функциональной активности.

Транспортные РНК (тРНК). Пространственную структуру любых тРНК, независимо от различий в последовательности нук-леотидов, описывают универсальной моделью "клеверного листа". В каждой молекуле тРНК есть участки цепи, не участвующие в образовании водородных связей между нуклеотидными остатками. К ним, в частности, относят участок, ответственный за связывание с аминокислотой на 3'-конце молекулы и антикодон - специфический триплет нуклеотидов, взаимодействующий комплементарно с кодоном мРНК. В состав нуклеотидов тРНК входят минорные основания (в среднем 10-12 оснований на молекулу). Они представлены метилированными основаниями, изомерами и аналогами пиримидинов. Минорные основания выполняют 2 функции: они делают тРНК устойчивыми к действию нук-леаз цитоплазмы и поддерживают определённую третичную структуру молекулы, так как не могут участвовать в образовании комплементарных пар, и препятствуют спирализации определённых участков в полинуклеотидной последовательности тРНК.

Матричные РНК (мРНК). Первичная структура всех мРНК, независимо от уникальности их кодирующей последовательности, имеет одинаковое строение 5'- и З'-концов. Так, на 5'- конце присутствует модифицированный нуклеотид 7-метилгуанозин-5'-трифосфат (кэп). Несколько десятков нуклеотидов отделяют кэп от инициирующего кодона, обычно это триплет -AUG-. За кодирующим участком следует один из терминирующих кодонов -UGA-, -UUA-, -UAG-. На 3'-конце большинства мРНК присутствует последовательность нуклеотидов из 100-200 аденозинмонофосфатных остатков.

Рибосомальные РНК (рРНК). Рибосомальные РНК имеют многочисленные спирализованные участки. Различают рРНК - 5S, 5,8S, 28S и 18S (S - коэффициент седиментации). Рибосомальные РНК содержат несколько модифицированных нуклеотидов, чаще всего это метилированные производные азотистых оснований или рибозы (2'-метилрибоза). рРНК образуют комплексы с белками, которые называют рибосомами. Каждая рибосома состоит из двух субъединиц - малой (40S) и большой (60S). Субъединицы рибосом различаются не только набором рРНК, но и количеством и структурой белков.

Прежде чем начнут синтезироваться белки, информацию об их строении необходимо "достать" из ДНК и доставить ее к месту синтеза белков. Этим занимаются информационные или матричные РНК. Одновременно клетке нужны транспортеры аминокислот – транспортные РНК и структурные компоненты органелл, синтезирующих белок, – рибосомальные РНК. Вся информация о строении транспортных и рибосомальных РНК также находится в ДНК. Поэтому существует процесс переписывания или транскрипции данных с ДНК на РНК – биосинтез РНК на матрице ДНК.

Как в любом матричном биосинтезе в транскрипции выделяют 5 необходимых элементов:

1)матрица – одна из цепей ДНК,

2)растущая цепь – РНК,

3)субстрат для синтеза – рибонуклеотиды (УТФ, ГТФ, ЦТФ, АТФ),

4)источник энергии – УТФ, ГТФ, ЦТФ, АТФ.

5)ферменты РНК-полимеразы и белковые факторы транскрипции.

Биосинтез РНК происходит в участке ДНК, который называется транскриптон, с одного края он ограничен промотором (начало), с другого – терминатором (конец).РНК-полимеразы эукариот имеют по две больших субъединицы и несколько малых субъединиц. Стадии транскрипции. Выделяют три стадии транскрипции: инициация, элонгация и терминация.

Инициация. Промотор содержит стартовый сигнал транскрипции – ТАТА-бокс. Так называется определенная последовательность нуклеотидов ДНК, связывающая первый фактор инициации ТАТА-фактор. Этот ТАТА-фактор обеспечивает присоединение РНК-полимеразы к той нити ДНК, которая будет использоваться в качестве шаблона для транскрипции (матричная нить ДНК). Так как промотор ассиметричен ("ТАТА"), то он связывает РНК-полимеразу только в одной ориентации, что определяет направление транскрипции от 5'-конца к 3'-концу (5'→3'). Для связывания РНК-полимеразы с промотором необходим еще один фактор инициации – σ-фактор, но сразу после синтеза затравочного фрагмента РНК (длиной 8-10 рибонуклеотидов) σ-фактор отрывается от фермента. Другие факторы инициации раскручивают спираль ДНК перед РНК-полимеразой.

Элонгация. Белковые факторы элонгации обеспечивают продвижение РНК-полимеразы вдоль ДНК и расплетают молекулу ДНК на протяжении примерно 17 нуклеотидных пар. РНК-полимераза продвигается со скоростью 40-50 нуклеотидов в секунду в направлении 5'→3'. Фермент использует АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ одновременно в качестве субстрата и в качестве источника энергии.

Терминация. РНК-полимераза остановится, когда достигнет терминирующих кодонов. С помощью белкового фактора терминации, так называемого ρ-фактора (греч. ρ – "ро"), от матрицы ДНК отделяются фермент и синтезированная молекула РНК, которая является первичным транскриптом, предшественником мРНК или тРНК или рРНК.

Сразу после синтеза первичные транскрипты РНК по разным причинам еще не имеют активности, являются "незрелыми" и в дальнейшем претерпевают ряд изменений, которые называются процессинг. У эукариот процессингу подвергаются все виды пре-РНК, у прокариот – только предшественники рРНК и тРНК. Процессинг предшественника матричной РНК. При транскрипции участков ДНК, несущих информацию о белках, образуются гетерогенные ядерные РНК, по размеру намного превосходящие мРНК. Дело в том, что из-за мозаичной структуры генов эти гетерогенные РНК включают в себя информативные (экзоны) и неинформативные (интроны) участки.

1. Сплайсинг – особый процесс, в котором при участии малых ядерных РНК происходит удаление интронов и сохранение экзонов.

2. Кэпирование – происходит еще во время транскрипции. Процесс состоит в присоединении к 5'-трифосфату концевого нуклеотида пре-мРНК 5'-углерода N7-метил-гуанозина.

"Кэп" необходим для защиты молекулы РНК от экзонуклеаз, работающих с 5'-конца, а также для связывания мРНК с рибосомой и для начала трансляции.

3. Полиаденилирование – при помощи полиаденилат-полимеразы с использованием молекул АТФ происходит присоединение к 3'-концу РНК от 100 до 200 адениловых нуклеотидов, формирующих полиадениловый фрагмент – поли(А)-хвост. Поли(А)-хвост необходим для защиты молекулы РНК от экзонуклеаз, работающих с 3'-конца.

Предшественники рРНК являются более крупными молекулами по сравнению со зрелыми рРНК. Их созревание сводится к разрезанию прерибосомной РНК на более мелкие формы, которые уже непосредственно участвуют в формировании рибосомы. У прокариот молекулы рибосомальной РНК совсем иные по своим свойствам (5S-, 16S-, 23S-рРНК), что является основой изобретения и использования ряда антибиотиков в медицине.

Процессинг предшественника транспортной РНК. 1. Модификация нуклеотидов в молекуле путем дезаминирования, метилирования, восстановления.

Например, образование псевдоуридина и дигидроуридина.

2. Формирование антикодоновой петли происходит путем сплайсинга и удаления интрона в средней части пре-тРНК.

3. Формирование на 3'-конце последовательности ЦЦА. Для этого у одних пре-тРНК с 3'-конца удаляются лишние нуклеотиды до "обнажения" триплета ЦЦА, у других идет присоединение этой последовательности.

Рибосома-органелла клетки, участвующая в биосинтезе белка, состоит из молекул РНК (т. наз. рибосомные рибонуклеиновые кислоты, или рРНК) и белков. Осн. масса Р. локализована в цитоплазме. В бактериальной клетке Р. составляют до 30% ее сухой массы: на одну бактериальную клетку приходится примерно 104 Р. Состоят из двух разделяемых субчастиц, или рибосомных субъединиц. При определенных условиях (напр., при понижении концентрации Mg2 + в среде) Р. обратимо диссоциирует на две субчастицы с соотношением их мол. масс ок. 2:1. Прокарйотическая 70S Р. диссоциирует на субъединицы с коэф. седиментации 50S (мол. м. 1,5•106) и 30S (мол. м. 0,85•106). Эукариотическая Р. разделяется на субчастицы 60S и 40S. Две рибосомные субчастицы объединены в полную Р. строго определенным образом, предполагающим специфич. контакты их поверхностей. Полисома - Временный комплекс (4-5 и более) рибосом, транслирующих одновременно одну молекулу мРНК. Наличие в цитоплазме клеток значительного количества полисом свидетельствует о высокой интенсивности синтеза белка в конкретный момент времени. Много рибосом одновременно участв в синтезе белка на одной и той же мРНК, образ комплекс-полисому. Полирибосомы могут сущ в виде частиц, плавающих в цитоплазме клеток. Полирибосомы. По причине того, что продолжительность жизни матричной РНК невелика, перед клеткой стоит задача использовать ее максимально эффективно, т.е. получить максимальное количество "белковых копий". Для достижения этой цели на каждой мРНК может располагаться не одна, а несколько рибосом, встающих последовательно друг за другом и синтезирующих пептидные цепи. Такие образования называются полирибосомы.

АМИНОАЦИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗЫ [аминокислота: тРНК-лигазы (образующие АМФ)], ферменты класса ли-газ, катализирующие аминоацилирование транспортной РНК (тРНК) по схеме:

где аминоацил-тРНК-синтетаза - фермент, АК - активируемая аминокислота, АТФ - аденозинтрифосфат, ПФ - пирофосфат, АМФ - аденозинмонофосфат. Карбоксильная группа аминокислоты в АК-АМФ связана ангидридной связью с остатком фосфорной к-ты (см. ф-лу; R'-ацил аминокислоты, R = Н), а в АК - тРНК - сложноэфирной связью с гидроксильной группой в положении 2' или 3' рибозы концевого остатка аденозина тРНК .

Каждая аминоацил-тРНК-синтетаза специфична только по отношению к одной из 20 аминокислот, входящих в белки, и к одной или нескольким тРНК. Для тех аминокислот, для которых открыты две и более тРНК, соответствующая аминоацил-тРНК-синтетаза катализирует аминоацилирование всех этих тРНК. Это обстоятельство чрезвычайно важно, поскольку в дальнейшем в белковом синтезе «узнавание» аминоацил-тРНК основано не на природе аминокислоты, а на химической природе антикодона тРНК. Считается, что в молекуле каждой аминоацил-тРНК-синтетазы имеется по крайней мере 3 центра связывания: для аминокислоты, тРНК и АТФ. Аминоацил-тРНК-синтетазы в активном центре содержат гистидин, имидазольное кольцо которого участвует в связывании АТФ посредством ионов Mg2+. Специфичность р-ций, катализируемых аминоацил-тРНК-синтетазами, очень высока, что определяет точность белкового синтеза в живой клетке. Если аминоацил-тРНК-синтетаза осуществит ошибочное аминоацилирование тРНК близкой по структуре аминокислотой, произойдет коррекция путем катализируемого той же аминоацил-тРНК-синтетазой гидролиза ошибочных АК-тРНК до АК и тРНК. В цитоплазме содержится полный набор аминоацил-тРНК-синтетаз, кодируемых ядерным геномом; в хлоропластах и митохондриях есть свои аминоацил-тРНК-синтетазы.