Практические занятия / Дополнительные материалы / Биология и генетика / Лекции / Genetica 7

9

мосомные библиотекиGenetica 7

В лекции рассматриваются следующие вопросы:

1. Методы изучения генетики человека.

2. Понятие о генной инженерии

При изучении генетики человека широко используются следующие методы исследования:

- семейно-генеалогический;

-близнецовый;

- дерматоглифики;

- цитогенетический;

- популяционно-статистический;

- метод генетики соматических клеток;

- биохимический;

- методы молекулярной биологии.

В 1892 г. Ф. Гальтон предложил метод изучения кожных гребешковых узоров пальцев и ладоней, а также сгибательных ладонных борозд, которые являются индивидуальной характеристикой человека и не изменяются в течение его жизни.

Эти признаки наследуется по полигенному типу и на их проявление большое влияние оказывает организм матери.

Изменения гребешковых узоров пальцев и ладоней наблюдаются при многих хромосомных болезнях человека. Дерматоглифические исследования используются при определении зиготности близнецов . Применяют этот метод и в криминалистике.

Центромера - компактный участок хромосомы, к которому при делении клетки прикрепляются волокна веретена деления. 

Теломера - концевой участок линейной хромосомы, необходимый для ее репликации и стабильности. 

Короткое плечо (р) - меньший по размеру участок хромосомы от центромеры до теломеры.

Длинное плечо - более длинный участок хромосомы от центромеры до теломеры.

Принцип метода флюоресцентной гибридизации {FISH).

1. Для изучаемой хромосомы или её участка, готовят однонитевой участок ДНК, к которому присоединяется биотин или дигоксигенин ( ЗОНД)

2. Микроскопические препараты подвергают специальной обработке, в результате чего хромосомная ДНК денатурируется, т.е. разрываются связи между двумя нитями ДНК.

3. Зондом обрабатывают препарат. При этом ДНК-зонд присоединяется к хромосоме только в тех участках , где располагаются взаимно комплементарные основания. В результате в этих участках происходит ренатурация ДНК.

4. После этого препарат обрабатывают веществом, меченым фдуоресцентными красителями, которое избирательно присоединяется к биотину или дигоксигенину.

5. Препарат просматривают с помощью люминесцентного микроскопа. Окрашенные хромосомы хорошо видны на фоне неокрашенных.

Популяционно-статистический метод используется для изучения генетической структуры популяций, определения частоты отдельных генов и генотипов в человеческих популяциях. Сущность этого метода заключается в сборе необходимой информации о частоте встречаемости тех или иных признаков путем выборочного обследования части популяции и статистическом анализе полученных данных.

Расчет частоты отдельных генов и генотипов производится на основании уравнения Харди- Вайнберга, согласно которому частоты аллелей и генотипов в идеальной популяции в процессе смены поколений остаются постоянными и связаны между собой квадратичными отношениями. Это уравнение имеет следующий вид:

(р + q)2 = р2 + 2 pq +q2 = 1

где: р - частота доминантного аллеля А данного гена, q - частота рецессивного аллеля а данного гена; р2 - частота гомозигот (АА) по доминантному признаку, 2 pq - частотa гетерозигот (Аа), q2 - частота гомозигот (аа) по рецессивному признаку. Сумма аллелей р+q=1.

Рассмотрим на конкретном примере возможности использования уравнения Харди – Вайнберга для определения частоты аллелей и генотипов в популяции.

Допустим, что в какой-то человеческой популяции два человека из 20000 обследованных имеют признаки альбинизма, проявляющегося фенотипически отсутствием пигмента в коже, волосах, а также в радужной оболочке глаз и наследуемого по аутосомно –рецессивному типу. Необходимо установить частоту гетерозиготных носителей аллеля альбинизма.

С этой целью сначала определяют частоту гомозигот по рецессивному аллелю альбинизма (q2), у которых соответствующий признак проявляется в фенотипе. В нашем случае q2= 2:20000=1/10.000=0,0001, и, следовательно, частота алллеля альбинизма q=√ 0,0001=0,01. Частота доминантного аллеля А составит р= 1- q= 1-0.01 = 0,99. Вычислив частоты аллелей а и А, можно определить частоту гетерозиготных носителей аллеля альбинизма (2рq). Она будет равна 2 х (0,99) х (0,01) = 0,0198. Как видим, частота носителей аллеля альбинизма почти в 200 раз превышает частоту фенотипического проявления этого дефекта.

Для генов сцепленных с полом частота встречаемости генотипов среди лиц женского и мужского пола неодинакова. У индивидуумов женского гомогаметного пола она совпадают с частотами генотипов для аутосомных генов. У гемизиготных лиц мужского пола, имеющих лишь одну Х-хромосому, которую они наследуют от матери, частоты генотипов для генов, сцепленных с полом, совпадают с частотами аллелей - р для А и q для а.

Например, гемофилия у лиц мужского пола встречается с частотой (q) 1/10000 (1 на 10 тыс.). Следовательно, согласно закону Харди-Вайнберга, частота в популяции рецессивного аллеля (а), определяющего гемофилию равна 0,00001, а вероятность проявления этой болезни у женщин (q2) составит 1/100000000 (1 на 100 млн.).

Наличие в популяциях людей большого числа скрытых носителей вредных аллелей многих наследственных аномалий, должно учитываться при профилактике наследственных болезней, в частности, при определении риска появления больных с наследственной патологией, который существенно возрастает при заключении близкородственных браков.

Биохимический метод широко применяется в диагностике наследственных болезней, обусловленных генными мутациями и при выявлении гетерозиготных носителей рецессивных генов, определяющих их возникновение. Среди таких заболеваний наиболее распространены болезни, связанные с нарушениями структуры и функции ферментов, транспортных, структурных или иных белков.

При фенилкетонурии в моче обнаруживается фенилпировиноградная кислота, а в крови отмечается повышение содержания фенилаланина.

Гетерозиготные носители фенилкетонурии в популяциях людей встречаются с частотой 1:50 – 1:70. Для их выявления в ряде стран производится анализ крови на фенилаланин у всех новорожденных.

Молекулярно-генетические методы включают комплекс разнообразных методик, применяемых для исследований ДНК, РНК и генетических механизмов синтеза белков. Они позволяют определять нуклеотидную последовательность ДНК генов, ( секвенировать гены) точно локализовать генные мутации, выделять и размножать ( клонировать ) отдельные фрагменты ДНК

Этапы получения кДНК эукариотических генов

1. Выделение м РНК –продукта данного гена

2. Синтез на матрице м РНК кДНК с помощью фермента обратной транскриптазы

3. Деградация мРНК , используемой для синтеза кДНК

4. Синтез двойной спиралди к ДНК , состоящей только из экзонов.

Принцип секвенирования ДНК с помощью дидезоксиметода

1. Исследуемый одноцепочечный фрагмент ДНК делится на 4 фракции

2. Синтез новой цепи в каждой пробе осуществляется в присутствии только одного из 4 -х дидеоксирибонуклеотидов.

3. Новые ДНК цепи в каждой реакционной смеси разделяются с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

4. Последовательность нуклеотидов цепи можно лдегко прочитать на электрофореграмме.

5. Исходя из последовательности нуклеотидов вновь синтезированной новой цепи, определяют последовательность нуклеотидов матрицы

Молекулярно –генетические методы

1.Получение образцов ДНК для исследования

- получение всей ДНК

• получение определенных фрагментов

2. Амплификация ДНК с помощью ПЦР

3. Рестрикция ДНК на фрагменты

4. Электрофорез фрагментов ДНК

5. Идентификация фрагментов ДНК

Специфические фрагменты ДНК выделяют с помощью блот-гибридизации по Саузерну.

Для каждого индивидуума распределение минисателлитов является характерным и называется дактилоскопическим отпечатком

Если использовать два однолокусных зонда , то появятся 4 полосы , если 3 – то 6 и т.д.

Имеется 1 шанс из 256 , что у двух человек будут 4 одинаковые полосы , и менее чем 1 шанс из 1012 , что они будут иметь 20 одинаковых полос.

При использовании одного однолокусного зонда полосы будут совпадать максимум в 1 случае из 100, двух зондов- в 1 случае из 10000, трех зондов- в 1 случае из 1000000.

Генная инженерия – совокупность методов манипулирования нуклеиновыми кислотами in vitro ( в пробирке ), позволяющих переносить генетическую информацию из одного организма в другой.

Общий план создания трансгенных организмов, геном которых содержат фрагменты ДНК разных видов, включает следующие этапы:

1.Выделение гена, контролирующего интересующий признак

2.Встраивание гена в плазмиду или другую молекулу ДНК, способную к репликации в клетке–хозяине.

3.Введение плазмиды - рекомбинантной ДНК, включающей полинуклеотидные последовательности разных организмов, в клетку хозяина

4. Отбор клеток, содержащих рекомбинантную ДНК с нужным геном.

5. Получение многих копий генов (клонирование генов) путем размножения бактерий, несущих рекомбинантную ДНК.

Этапы клонирования гена человека в бактериальной плазмиде

1. Рестрикция ДНК плазмид , например , в области Lac Z гена, с превращением ее в линейную структуру

2. Разрезание ( рестрикция ) ДНК человека на фрагменты , содержащие

интересующий ген ,с помощью одного из ферментов – рестриктаз. Выделение генов из смеси.

3. Вставка интересующего гена в плазмиду в область Lac Z- гена и получение рекомбинантных плазмид

4. Введение рекомбинантных плазмид в Lac Z ген бактерии путем трансфекции (одна рекомбинанатная плазмида приходится на 105 клеток)

5. Высев бактерий , на селективные питательные среды , обеспечивающие рост только тех из них, которые содержат рекомбинантные плазмиды

6. Идентификация колоний , содержащих рекомбинантные ДНК,

7. Выделение клонированных генов и их характеристика.

Этапы клонирования

I- выделение плазмиды и ДНК нужного гена;

II-III-встраивание гена в плазмиду;

IV-введение плазмиды c геном в клетку кишечной палочки;

V- отбор клеток кишечной палочки c нужным геном;

VI- клонирование клеток кишечной палочки c нужным геном

Этапы клонирования

I-выделение мРНК нужного гена;

II-синтез на матрице мРНК однонитевой цепи кДНК;

III-гидролиз мРНК синтез двухнитевой кДНК;

IV-трансформация бактерий плазмидами, содержащими кДНК;

V- отбор клонов трасформированных бактерий путем молекулярной гибридизации ДНК.

В настоящее время созданы:

-геномные библиотеки;

• библиотеки к ДНК;

• хро