Механизмы Серологических Реакци Иммунология

в) Постановка ориентировочной реакции агглютинации с ти- повыми адсорбированными сальмонеллезными Н- сыворотками. Испытать чистую культуру сальмонелл в пла- стинчатой реакции агглютинации с типовыми Н-сыворотками

вразведении 1:5, содержащей АТ к сальмонеллам, входящим

всерогруппу сальмонелл, с групповой сывороткой которой произошла реакция на предыдущем этапе.

11.Произвести серотипирование выделенной чистой куль- туры Shigella реакцией Ко-агглютинации.

Ингредиенты:

1.Набор КоА реагентов (Ко-А реагент к Sh. Sonne, Ко-А реагент к Sh. Flexneri).

2.Исследуемый материал.

3.Физиологический раствор.

Постановка реакции. На предметное стекло, положенное на лист черной бумаги, наносят капли Ко-А реагентов и кап- лю физиологического раствора (для контроля культуры на спонтанную агглютинацию). Затем вносят титруемую культу- ру во все капли. Покачивая стекло, наблюдают коагглютина- цию. Реакцию учитывают по 3-х плюсовой шкале:

( +++ ) − полная коагглютинация, полное просветление фона,

(++ )	−	хорошо выраженная коагглютинация, явное просвет-
		ление фона,
( +)	− неполная коагглютинация, слабое просветление фона,
(-)	–	отсутствие коагглютинации, реакция отрицательная.

Заключение о принадлежности выделенной культуры де- лают на основании положительной реакции Ко-агглютинации не менее, чем на (++) 2 креста при отсутствии спонтанной агг- лютинации в контроле.

21

111. Произвести серотипирование выделенной чистой культу- ры Shigella с помощью РНГА.

Ингредиенты: 1.Исследуемый материал.

2.Эритроцитарные диагностикумы антительные к Sh. Sonne,

к Sh. Flexneri. 3.Физиологический раствор.

Постановка реакции. В лунки полистиролового планшета вносят дизентерийные эритроцитарные диагностикумы анти- тельные (по 0,25 мл), в одну лунку ( для контроля) добавляют 0,25 мл физиологического раствора, во все лунки вносят взвесь культуры шигелл по 0,25 мл. Встряхивают планшеты и ставят на 2 часа в термостат. Учет проводят по внешнему виду осадка и по прозрачности надосадочной жидкости.

Вотрицательной реакции эритроциты оседают на дно в ви- де плотного диска с ровными краями («пуговка»), в положи- тельной – осадок имеет вид кружев («зонтик»).

Вслучае титрования антигена из антигенсодержащего ма- териала готовят серию двукратных разведений в объеме 0,25 мл и к ним доливают по 0,25 мл антительного эритроцитар- ного диагностикума.

Учет такой же, как и в предыдущем варианте.

Титр – последнее разведение, где реакция идет на 2 креста

1V. Выявить в сыворотке крови специфические агглюти- нины к бруцеллам развернутой реакцией агглютинации Рой- та.

Ингредиенты: 1.Исследуемая сыворотка. 2.Физиологический раствор.

3.Единый бруцеллезный диагностикум.

22

Постановка реакции. Приготовить основное разведение (1:50) исследуемой сыворотки: внести в пробирку 0,2 мл неразве- денной сыворотки, добавить к ней 9,8 мл раствора хлорида натрия и тщательно перемешать. Из основного разведения сы- воротки сделать ряд последовательных, кратных двум разве- дений от 1:100 до 1:1600 в агглютинационных пробирках, ус- тановленных в штатив.

Затем прибавить по 3 капли бруцеллезного диагностикума. Поставить контроли: контроль сыворотки (1 мл сыворотки в разведении 1:50 ) и контроль диагностикума (3 капли диагно- стикума и 1 мл физ. раствора). Штатив с пробирками встрях- нуть и поместить в термостат при 37 о С на 18-20 часов.

Таблица

Схема постановки опыта

						Контроль	Контроль
Ингредиенты		Доза реагентов, мл				АТ	АГ
Физ.раствор	1	1	1	1	1	-	1
Сыворотка	1	1	1	1	1	1	-
исследуемая
АТ (1:50)
Полученное	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600
разведение
Бруцеллезный	3	3	3	3	3	-	3
диагностикум
(капли)
Результаты
							23

Провести учет основываясь на величине осадка и степени просветления жидкости. Контроль сыворотки должен быть прозрачным. Контроль АГ – равномерно мутным. Если кон- троли хорошие, устанавить наличие и степень агглютинации во всех опытных пробирках, которую обозначают плюсами:

(++++) – большой осадок и полное просветление, (+++) – большой осадок и неполное просветление жидкости,

(++)– заметный осадок и заметное просветление жидкости,

(+) – очень слабый осадок и слабое просветление жидкости, (-) – отрицательная реакция, раствор мутный.

Сделать выводы по реакции, учитывая что диагностиче- ский титр при бруцеллезе 1:200.

V. Выявить в сыворотке крови антитела к шигеллам в реак- ции пассивной гемагглютинации.

Ингредиенты: 1.Исследуемая сыворотка.

2.Эритроцитарный диагностикум Sh. Sonne.

3.Эритроцитарный диагностикум Sh. Flexneri.

4.Физиологический раствор.

Постановка реакции. Приготовить основное разведение (1:50) исследуемой сыворотки, смешивая в пробирке 0,2 мл сыво- ротки и 0,8 мл физиологического раствора.

В 2-х рядах лунок полистиролового планшета последова- тельно развести в физиологическом растворе исследуемую сыворотку в объеме 0,5 мл от 1:100 до 1:6400. Во все лунки первого ряда внести по 0,25 мл эритроцитарного диагности- кума Sh. Sоnne, второго ряда по 0,25 мл эритроцитарного ди- агностикума Sh. Flexneri.

24

Для проверки спонтанной агглютинации диагностикумов в лунки внести по 0,25 мл диагностикумов и 0,5 мл физиологи- ческого раствора. Встряхнуть планшеты и поместить в термо- стат при 37 о С на 2-3 часа.

Учесть реакцию по внешнему виду осадка эритроцитов и прозрачности надосадочной жидкости.

Таблица

Схема постановки опыта по РСК

Ингредиенты		Доза реагентов			( мл )			Контроль
Физиологический
раствор	0,5	0,5	0,5	0,5	0.5	0,5	0,5	0,5
Сыворотка исследуемая
в разведении 1:50	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	-
Полученное разведение								-
	1:100	1:200	1:400	1:800		1:1600	1:3200
	1:6400
Эритроцитарный диаг-
ностикум из шигелл	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25

25

2. РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ - это агрегация антите-

лами (преципитинами) растворимых (молекул) АГ (преци- питиногенов), проявляющаяся в помутнении прозрачной жид- кости, в появлении преципитата в виде осадка, кольца и т.д. Таким образом, в отличие от реакции агглютинации, антиген для реакции преципитации обязательно должен быть в моле- кулярном виде.

Механизм реакции преципитации аналогичен реакции агг- лютинации, т.е. по «теории решетки».

Осаждение из раствора комплексов АГ - АТ происходит в диапазоне эквивалентных соотношений концентраций взаи- модействующих молекул. В случае большого избытка одного из реагентов образуется растворимый комплекс АГ-АТ и фе- номен реакции не проявляется.

Поскольку преципитиноген имеет ультрамикроскопическое строение и его концентрация в единице объема выше, чем АТ в таком же объеме сыворотки, то для осаждения более легких частичек АГ с образованием видимого преципитата необхо- димо значительно большее количество АТ. Поэтому диагно- стические преципитирующие сыворотки выпускают с высо- ким титром АТ.

Реакцию преципитации можно проводить в жидкой и твер- дой среде.

26

Реакция преципитации в жидкой среде

Обязательным условием постановки реакции преципитации (РП) в жидкой среде является максимальная прозрачность иммунореагентов. Реакция происходит при смешивании рас- творов АГ и АТ или наслоения одного иммунореагента на другой. В этом случае по характеру образовавшего преципи- тата (в виде кольца) реакция получила название кольцепреци-

питации.

Реакция преципитации в агаре ( геле )

Для реакции используют гель, приготовленный из агара Дифко или же специально приготовленный предельно освет- ленный гель из агар-агара.

Сущность реакции заключается в том, что специфические Ат и АГ диффундируют в гель, взаимодействуя между собой, и образуют комплекс, который осаждается в виде линии пре- ципитата.

Радиальная иммунодиффузия в геле может быть простой и двойной.

Двойная иммунодиффузия по Оухтерлони.

Вагаре, разлитом тонким слоем в чашки или же на пред- метное стекло, вырезают лунки на равном расстоянии друг от друга ( 4 – 10 мм ) при помощи специальных штампов или стеклянных трубок с ровными краями.

Влунки вносят раствор сыворотки или раствор антигена в различных разведениях. Из лунок АГ и АТ диффундируют навстречу друг другу и образуют преципитат в виде тонких белесоватых линий. Поскольку диффузия реагентов из лунок

вгель происходит радиально, это позволяет анализировать сразу несколько образцов иммунореагентов, разместив вокруг лунки с антисывороткой несколько лунок с растворами раз- ных антигенов; или наоборот, заполняя периферические лунки антисывороткой, а центральную искомым антигеном; или в

27

центральную лунку внести известный АГ, а в перифериче- ские – исследуемую сыворотку в разных разведениях.

Метод двойной иммунодиффузии применяют преимуще- ственно для качественного анализа, для определения природы АГ и АТ, но можно использовать и для полуколичественного определения АГ и АТ путем их титрования.

Для количественного определения антигена часто исполь-

зуют простую радиальную иммунодиффузию по Манчини,

которая основана на измерении диаметра кольца преципита- ции, образующегося при внесении раствора исследуемого АГ в лунки, вырезанные в слое геля, в котором предварительно диспергирована моноспецифическая антисыворотка.

В стандартных условиях опыта диаметр кольца преципита- ции прямо пропорционален концентрации исследуемого АГ.

Содержание АГ определяют относительно стандартного раствора АГ с известной его концентрацией. Чаще всего при помощи этого метода определяют белковые АГ: количество Yg разных классов в сыворотке крови и других жидкостях, секретов желез, белков крови, спинномозговой жидкости и т.д.

Реакцию иммунодиффузии обычно поводят при комнатной температуре, во влажных камерах. Продолжительность имму- нодиффузии зависит от природы АГ.

Методы иммунодиффузии обладают высокой специфично- стью и чувствительностью.

Практическое применение реакции преципитации.

РП применяются:

-для изучения АГ структуры бактерий, сложных белков, жидкостей человека и

животных;

-для изучения токсигенности бактерий;

-при диагностике ряда инфекционных заболеваний бактери- альной, вирусной,

грибковой природы (сибирской язвы, чумы, туляремии и т.д.);

В качестве АГ используют раневые экссудаты, фильтраты экстрактов пораженных органов, спинно-мозговую жид- кость и т.д.

-для установления степени родства видов микроорганизмов, растений, животных –

определяют общий АГ;

-в судебно-медицинской практике – для определения видо- вой принадлежности

белков (крови, слюны, спермы и т.д.);

-для выявления примесей в мясных, рыбных, мучных изде- лиях.

ФЛОККУЛЯЦИЯ – вид иммунопреципитации, при котором преципитат представляет собой хлопьевидную массу. Реак- цию проводят смешиванием разных разведений сыворотки со стандартным количеством раствора АГ в объеме 2 мл. Первая пробирка, где появились хлопья ( инициальная флоккуляция ) указывает на эквивалентное соотношение АГ и АТ. По инициальной флоккуляции рассчитывают количе- ство сыворотки или АГ, исходя из активности взятых в опыт

стандартных препаратов.

ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ. Вначале проводят электрофо- ретическое разделение АГ в забуференном агаровом геле. После разделения в канавку, которая идет в направлении ми- грации антигенных веществ, вносят преципитирующую им- мунную сыворотку. АГ и АТ диффундируют в геле навстречу друг другу и в месте их взаимодействия образуется дуга пре- ципитации. Дуга – потому что АГ диффундирует из точечно- го источника радиально, а АТ из канавки – ровным фронтом. Это встречный иммуноэлектрофорез.

СХЕМА:

На основе сочетания электрофореза с иммунопреципитацией разработано несколько удачных методов, в каждом из кото- рых перемещение АГ в электрическом поле приводит к его контакту с АТ.

Непрямая преципитация иммунных комплексов.

По целому ряду причин в результате реакции АТ с АГ могут образовываться растворимые комплексы.

Важное значение имеет определение циркулирующих иммун- ных комплексов (ЦИК) при некоторых патологических со- стояниях макроорганизма.

Часто для осаждения ЦИК используют раствор полиэти- ленгликоля (ПЭГ). Есть несколько методик осаждения ПЭГ. Например, можно определить концентрацию ЦИК измерени- ем убыли белка в надосадочной жидкости после осаждения 2% раствором ПЭГ.

Методика:

1)В исследуемой сыворотке определить концентрацию белка биуретовым методом.

2)В пробирки внести 0,5 мл сыворотки и 0,5 мл 4% раствора ПЭГ (М=6000) на физрастворе (рН 7,2 ). 2% раствор ПЭГ (конечная концентрация) не осаждает белки в сыворотке здоровых яиц, а только иммунные комплексы, в том числе

ирастворимые. В контрольную пробирку вносят 0,6 мл физраствора и 0,5 мл сыворотки. Пробирки закрыть и оста- вить на 18 часов при комнатной температуре

3)После инкубации пробирки центрифугировать 45 минут при 6000 об/мин.

4)В сухие пробирки внести по 0,1 мл надосадочной жидкости

и4,9 мл физраствора. Определить концентрацию белка в опыте и контроле относительно физраствора, содержащего ПЭГ ( 0,5 мл физраствора и 0,5 мл 4% раствора ПЭГ). По