Механизмы Серологических Реакци Иммунология

чумы. Как можно провести экспресс-диагностику при на- личии: кроличьей чумной сыворотки, антикроличьей лю- минесцентной сыворотки, буферных растворов.

Можно провести РИФ (непрямой вариант).

1.На предметное стекло нанести мокроту от больного, зафиксировать.

2.Нанести диагностическую чумную кроличью сыво- ротку.

3.Выдержать во влажной камере 20 минут при комнат- ной температуре.

4.Мазки промыть дважды буферным раствором.

5.Нанести на мазок люминесцентную антикроличью сы- воротку (АТ кYg кролика, меченые флюорохромом).

6.Выдержать во влажной камере 15-20 минут при ком- натной температуре.

7.Промыть дважды буферным раствором, подсушить, микроскопировать, используя люминесцентный мик- роскоп.

8.Положительный ответ дать при наличии яркого свече- ния, локализующегося по периферии клетки.

4)В серологическую лабораторию поступила кровь от боль- ного с подозрением на

бруцеллез.

Задание: определить титр иантибруцеллезных АТ, если в лаборатории имеется:

а) бруцеллезный диагностикум, б) люминесцентная сыво- ротка против Yg человека,

в) буферные растворы, г) положительная сыворотка (есть АТ к бруцеллезному АГ),

д) отрицательная сыворотка (АТ к бруцеллезным АГ нет). Можно поставить РИФ (непрямой вариант).

1.На предметное стекло нанести 5 капель бруцеллезно- го диагностикума ( 5 маленьких мазков), зафиксировать.

2.Из крови отделить сыворотку, сделать ее разведения в физрастворе (1:100, 1:200, 1:400 ).

3.На первые три мазка бруцеллезного диагностикума нанести испытуемую сыворотку в разных разведениях (опыт).

4.На 4 мазок – положительную сыворотку ( КПС ).

5.На 5 мазок – отрицательную сыворотку ( КОС ),

6.Стекло поместить во влажную камеру на 20 минут при комнатной температуре.

7.Промыть дважды буферным раствором.

8.Нанести на все мазки люминесцентную сыворотку против Yg человека.

9.Выдержать во влажной камере 20 минут при комнат- ной температуре.

10.Промыть дважды буферным раствором, подсушить.

11.Промикроскопировать в люминесцентном микроско- пе, начиная с контролей.

В мазке с отрицательной сывороткой никакого свечения не должно быть, наоборот, с положительной сывороткой

– яркое свечение. Учесть опытные капли и по свечению сделать выводы о наличии и титре АТ к бруцеллезному антигену.

5) Определить титр токсоплазменных АТ в сыворотке бере- менной женщины, если в

лаборатории имеются: а) токсоплазменный АГ (корпуску- лярный), б) комплемент,

в) сыворотка против глобулинов морской свинки, г) поло- жительная сыворотка,

д) отрицательная сыворотка , е) буферные растворы. Можно поставить РИФСК.

1.На предметное стекло нанести 6 капель токсоплазмен- ного АГ, зафиксировать.

2.Исследуемую сыворотку развести стерильным физрас- твором 1:5, 1:10, 1:15, 1:20 и нанести на фиксирован- ный токсоплазменный АГ (первые 4 капли).

3.На 5-ю каплю нанести положительную сыворотку в разведении 1:5.

4.На 6-ю каплю отрицательную сыворотку 1:5.

5.Во все капли внести раствор комплемента в разведе-

нии 1:5.

6.Выдержать во влажной камере 15-20 минут при ком- натной температуре.

7.Мазки отмыть дважды буферным раствором.

8.Нанести на все мазки люминесцентную сыворотку против глобулинов морской свинки.

9.Выдержать во влажной камере 15-20 минут при ком- натной температуре.

10.Мазки отмыть буферным раствором, подсушить и промикроскопировать в люминесцентном микроскопе. Последнее разведение сыворотки, дающее яркое све-

чение является титром.

6). Определить титр токсоплазменных АТ в сыворотке бере- менной женщины, если в

лаборатории имеются: а) токсоплазменный АГ, б) токсо- плазменная люминесцентная

сыворотка.

Можно поставить РГИФ - реакцию гашения иммуноф- люоресценции.

1.На нанесенные и фиксированные мазки токсоплаз- менного АГ нанести исследуемую сыворотку в разведении 1:5, 1:10, 1:15, 1:20.

2.Выдержать во влажной камере 15-20 минут при ком- натной температуре.

3.Мазок промыть дважды буферным раствором.

4.Нанести на все мазки люминесцентную ирксоплаз- менную сыворотку.

5.Выдержать во влажной камере 15-20 минут при ком- натной температуре.

6.Мазки отмыть дважды буферным раствором, подсу- шить и промикроскопировать в люминесцентном микроскопе.

Последнее разведение сыворотки, не дающее свече- ние, является титром.

Иммуноферментный анализ.

Особенностью метода ИФА является использование функ- ционально активной биологической молекулы фермента. Комплекс конъюгированных иммунореагентов с ферментами ( ф ) проявляет функциональную активность, т. е. сохраняется высокая специфичность иммунореагентов и способность фер- мента расщеплять добавленный субстрат ( с ) с образованием легко обнаруживаемых продуктов. В связи с этим можно ре- гистрировать и учитывать количественно взаимодействие им- мунореагента, например АТ с гомологичным АГ.

Вначале ИФА использовали в иммуногистохимии для вы- явления локализации тканевых и клеточных АГ, а затем бы- ли разработаны варианты реакции, которыми можно качест- венно и количественно выявить иммунореагенты в жидко- стях.

Реагенты реакции:

1. Ферменты применяют только те, которые расщепляют суб- страт с образованием продуктов легко (улавливаемых) опре- деляемых: ПХ (пероксидаза хрена), ЩФ (щелочная фосфата- за), каталаза, уреаза, фосфолипаза и др.

Ферменты, используемые в ИФА должны отвечать сле- дующим требованиям: содержать в структуре определенные реакционные группы, по которым идет связывание с молеку- лой иммунореагента не меняя его специфичности; быть чис-

тыми; сохранять ферментативную активность в конъюгиро- ванном с иммунореагентом виде.

Субстрарами в зависимости от реагента используют: 5- аминосалициловую кислоту, ортофенилендиамин, пирогаллол

идругие.

2.Иммунореагенты.

Внастоящее время иммунореагентами, с которыми связы- вают ферменты, могут быть АТ, АГ.

Фермент присоединяют к иммунореагенту с помощью бифункциональных реагентов: глутарового альдегида, перио- дат натрия, фенилендималеимида и др. Эти соединения обла- дают химически активными группировками, которыми они ковалентно взаимодействуют с биомолекулами. Так, глутаро- вый альдегид реагирует преимущественно с E аминогруппа- ми аминокислот, в частности лизина, периодат натрия с угле- водными остатками.

ФЕРМЕНТЫ И ИХ СУБСТРАТЫ, НАИБОЛЕЕ ШИРОКО ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ИФА

Фермент	Источник	Субстрат
	получения
Пероксидаза	Хрен	5-аминосалициловая
		кислота
		Ортофенилендиамин,
		Н2 О2
Щелочная фосфа-	E. coIi, сли-	Р-нитрофенилфосфат
таза	зистая ки-
	шечника те-
	ленка
В-галактозидаза	E.coIi	О-нитрофенол

Глюкозооксидаза	Грибы As-	Глюкоза, О2
	pergillus
Глюкозоамилаза	Rhizopus	Декстрин
	nivens

3. Классификация и варианты ИФА

Существует множество вариантов ИФА.

Прежде всего ИФА включает две группы способов постанов- ки реакции: твердофазный (гетерогенный) – ТИФА и гомо- генный - ГИФА. Они в свою очередь подразделяются на раз- личные модификации.

3.1. Гетерогенный (твердофазный) способ - твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА).

Твердофазный способ постановки получил самое широкое применение. При этом способе АГ или АТ предварительно адсорбируют на твердый носитель (сорбционно и кова- лентно). В качестве твердой фазы используют различные микропористые (сефароза, стекло, биогель) и непористые носители (полистирол, полихлорвинил, нейлон, полисти- рен и другие). По физическому состоянию это могут быть гели, шарики, диски, титрационные панели.

Чаще всего для ИФА используют полистироловые, поли- виниловые пластинки с лунками, которые позволяют ад- сорбционно связывать АТ и АГ различной природы – бел- ки, ЛПС, гликопротеиды и т.д. Связывание происходит путем адсорбции (т.е. нековалентно) за счет гидрофобных или ионных сил, или конъюгацией (ковалентно). Для по- лучения иммуносорбентов путем ковалентной связи ис-

пользуют в основном такие сшивающие реагенты, как бромциан, глутаральдегид, изоцианаты, при этом в качест- ве твердой фазы применяют целлюлозу, биогель, сефадекс, агарозу и др.

Методы ТИФА применимы и при работе с корпускуляр- ным АГ, например, клетками бактерий и эукариот. Клетки бактерий можно прикрепить к панели высушиванием и усилить прикрепление фиксатором.

Например, перед адсорбцией клеток бактерий панели об- рабатывают поли-L- лизином

в течение 1 часа, лунки промывают и вносят бактериаль- ную взвесь (100мкл взвеси

5х103 - 5х104 в мл ), инкубируют 45 минут и фиксируют глутаровым альдегидом в

течение 3-5 минут. После связывания иммунореагента свободные места носителя

блокируют, чтобы предотвратить неспецифическое связы- вание с ним

иммунореагентов на следующих этапах. Для этого приме- няют различные белки и

реагенты: БСА (бычий сухой альбумин), нормальные сы- воротки, твин-20, желатин.

3.2. Варианты ТИФА.

Существуют неконкурентные и конкурентные варианты. При неконкурентных вариантах реакция АГ-АТ происхо-

дит на поверхности твердой фазы, ингредиенты добавляются последовательно и опре-

деляется количество метки, связавшейся с носителем

При этом количество связавшейся метки прямо пропор- ционально количеству

искомого АТ или АГ в исследуемом образце.

При конкурентных вариантах постановки реакции неме- ченый исследуемый образец

и известное количество меченого искомого вносят в лун- ки, сенсибилизируют АГ

или АТ одновременно, где происходит конкуренция меж- ду первым и вторым

образцами за связывание с твердофазным иммуносорбен- том. В этом случае

количество связанной с твердой фазой метки обратно пропорционально количеству

искомого образца.

3.2.1. Неконкурентные методы ТИФА. а) Прямой вариант

1). В лунки вносят исследуемый иммунореагент (чаще АГ) и выдерживают 16-20

часов при 4о или 2 часа при 37о . 2). Промывают буфером .

3). Производят блокировку свободных мест на носителе.

4). Промывают буфером.

5) . Вносят конъюгат иммуноферментов и выдерживают

2 часа при комнатной температуре или 30 минут при 37о С.

6). Промывают буфером (пятикратно)

7). Добавляют соответствующий фермнту субстрат, вы- держивают при комнатной

температуре в темном месте 30 минут.

8). Останавливают реакцию внесением в лунки, напри- мер, 0,9 мол/л Н2 SО4 .

9). Учитывают.

б). Непрямой вариант.

Принцип этой модификации можно выразить следую- щей формулой:

АГ + АТ ---- (АГхАТ) + (АТ2 х Ф)--- (АГхАТ1 хАТ2 х

Ф), где
АТ1	-антитело против АГ (АГ),
(АТ2 х Ф ) – конъюгат,
АТ2	– антитело против АТ1 ,
Ф –	фермент.

1). Адсорбция АГ (известного или исследуемого) на поверхности твердой фазы.

2). Внесение АТ против АГ (известных или исследуе- мых).

3). Промывка буфером.

4). Внесение иммуноферментного конъюгата – т.е. до- бавление энзиммеченого

антивидового иммуноглобулина. 5). Промывка буфером.

6). Внесение энзим-субстрата.

7). Останавливают реакцию внесением в лунки 0,9 мол/л Н2 SО4 .

8).Учет реакции.

в) .Метод «сэндвич».

На первом этапе к ТФ прикрепляются АТ 1 против АГ. На следующем этапе

добавляется искомый АГ.

После установления равновесия систему ( ТФ – АТ1 - АГ ) промывают и вносят меченые ферментом АТ2, кото- рые также специфичны к данному АГ, но к другим его эпитопам (ТФ – АТ 1 - АГ – АТ2 -Ф ). После отмывки до- бавляют энзим-субстрат.

Схема:

3.2.2. Конкурентные методы.

На первом этапе к ТФ прикрепляется АТ против искомого АГ.

Затем вносят испытуемую пробу и известное количество АГ, меченого ферментом, который конкурирует за центры связывания антител (важ- ным является правильный

подбор концентрации меченого АГ).

Или на первом этапе к ТФ прикрепляется АГ к искомым АТ (например, в сыворотке больного). Затем вносят исследуемую сыворотку (АТ? к АГ)

и известное количество коъюгирующей с ферментом им- мунной сыворотки, т.е. сыворотку с АТхФ к данному АГ. Эти сыворотки конкурируют за связывание с эпитопами ан- тигена.

Результаты ИФА регистрируют с помощью спектрофото- метров, измеряя оптическую плотность в опытных и кон- трольных лунках.