Praktikum_1

Ветеринарні біопрепарати готують на біофабриках, біокомбінатах, в науково-дослідних інститутах і лабораторіях за єдиними методиками.

Виготовлення і використання біопрепаратів потребує постійного державного контролю.

Основні підрозділи біофабрик: цех з виготовлення: вакцин, сироваток, діагностичних препаратів, біостимуляторів, лікувальних препаратів та утилізації й очищення відходів.

Основні приміщення: апаратні, термостатні, рефрижераторні, бактеріологічні й вірусологічні лабораторії, приміщення для продуцентів, науково-контрольна лабораторія, карантинник, віварій. Технологія виробництва деяких біопрепаратів є комерційною або технологічною таємницею.

Класифікація біопрепаратів

У практиці ветеринарної медицини біопрепарати використовують із профілактичною, лікувальною, стимулюючою та діагностичною метою і тому за призначенням їх поділяють на профілактичні, лікувальні, стимулюючі та діагностичні.

ПРОФІЛАКТИЧНІ ПРЕПАРАТИ

ВАКЦИНИ

Вакцини – це специфічні антигенні препарати, виготовлені з мікроорганізмів чи продуктів їх життєдіяльності, на введення яких організм формує імунітет до відповідної інфекційної хвороби. Їх використовують для активної імунізації людей, тварин та птахів із метою профілактики або лікування інфекційних захворювань.

Слово «вакцина» походить від назви збудника віспи корів (вірусвакцина), який англійський лікар Е. Дженер у 1796 р. уперше використав для імунізації людей проти віспи. Великий внесок у вчення про вакцини та профілактичні щеплення зробив французький вчений Луї Пастер (1822 – 1895 рр.). Своїми працями він перевів специфічну профілактику інфекційних захворювань із сфери емпіричних дослідів на наукову основу, розширив її і розробив методи

атенуації (послаблення) збудників (сибірки, бешихи свиней, пастерельозу

курей, сказу) та використання їх як вакцинного матеріалу.

Видатний російський вчений М. Ф. Гамалея у 1883 р. вперше провів досліди з виготовлення вакцин з інактивованих збудників інфекційних захворювань. Французький бактеріолог Г. Рамон у 1923

70

р. вперше одержав анатоксин. У травні 1980 р. кілька науководослідних інститутів Франції за допомогою нових біотехнологічних методів одержали генетично сконструйовані клітини бактерій і мишей, які мали властивість синтезувати білок вірусу гепатиту, що викликав у щеплених тварин несприйнятливість до вірусу.

Типи вакцин

Живі; живі ослаблені; інактивовані; анатоксини; хімічні; генноінженерні.

Згідно з традиційним принципом класифікації всі вакцинні препарати поділяють на: живі та інактивовані. Перші – містять живі,

як правило атенуйовані (штучно, стійко ослаблені - знижена вірулентність за рахунок адаптації збудника до організму несприйнятливих тварин чи за рахунок пристосування до несприятливих умов навколишнього середовища; дії бактеріофага, антибіотиків, променистої енергії) штами, чи серовари, які

відрізняються здатністю розмножуватися в щепленому організмі (реплікуючі антигени). Другі – готують з інактивованих мікроорганізмів чи їх антигенних та імуногенних компонентів (нереплікуючі антигени).

Деякі збудники (поліомієліт, ящур, грип, лептоспіроз) існують у вигляді

декількох різних антигенних типів (серотипів) і імунізація проти одного з цих типів не захищає від зараження іншими, тому ефективна профілактика можлива лише при вакцинації полівалентною вакциною, що містить антигени декількох антигенних типів даного збудника. Залежно від кількості антигенів, що містяться у вакцині,

розрізняють: моновакцини (проти бешихи свиней, віспи овець); дивакцини (проти ентеротоксемії й брадзоту овець); полівакцини, до

складу яких входять кілька антигенів збудників різних захворювань.

Вакцини, що містять антигени більше ніж одного виду збудника називають комбінованими (асоційованими), а імунізацію ними тварин

– комплексним щепленням. Так щеплюють свиней проти сальмонельозу, пастерельозу, бешихи й хвороби Ауєскі. Готують такі вакцини на біофабриках.

Окрім цього вакцини бувають гомологічні – містять антигени проти вірулентного вірусу чи його вірулентних мутантів та гетерологічні – містять перехреснореагуючі антигени і створюють

достатній імунітет (антиген віспи корів створює імунітет проти віспи людини, внаслідок чого відносно легка хвороба запобігає більш важкій, що викликається іншим антигенноспорідненим вірусом).

71

Вимоги до вакцини:

вони повинні створювати тривалий напружений імунітет;

бути генетично стабільними (слугувати зразком для нової партії

вакцини);

бути відносно дешевими та простими у виготовленні;

містити мінімальну кількість баластних речовин та не мати

сторонніх домішок, непередбачених технологією (у вакцинах не

повинно міститися будь-яких біологічних контамінантів – бактерій, мікоплазм, вірусів, токсинів);

бути досить імуногенними та слабореактогенними (не проявляти

клінічних та інших сторонніх реакцій у щеплених тварин).

Живі атенуйовані вакцини

Їх виготовляють з атенуйованих слабовірулентних штамів бактерій або вірусів, які не здатні викликати захворювання, але їх залишкова вірулентність дає змогу розмножуватися в організмі щепленої тварини, викликає доброякісний інфекційний процес, у результаті якого в організмі виробляються специфічні антитіла.

Атенуйовані штами одержують відбиранням спонтанних мутантів, або ж штучним послабленням вірулентності мікроорганізмів при пасажах на інших видах тварин чи курячих ембріонах, вирощуванні на нехарактерних для мікроорганізму поживних середовищах, при дії

фізичних (температура, ультрафіолетове, рентгенівське та гамма-опромінення) і

хімічних факторів. Одержані мутанти повинні стійко передавати свої властивості за спадковістю. Наприклад, вакцина СТІ проти сибірки виготовлена із варіанта вірулентного штаму, який втратив властивість утворювати захисну капсулу в організмі (Гінсбург Н.Н., 1924), що призвело до різкого зниження вірулентності цього препарату.

Завдяки залишковій вірулентності, властивості розмножуватися в організмі, живі вакцини мають виражену імуногенність, імунітет розвивається протягом кількох днів, має високу напругу і на тривалий період; вакцину вводять одноразово, в невеликій кількості.

Недоліки живих вакцин

можливі ускладнення в ослаблених тварин внаслідок залишкової вірулентності;

робота з живими вакцинами потребує великої обережності, щоб не допустити поширення вакцинного штаму у зовнішньому середовищі;

за один – два дні до вакцинації, і протягом тижня після

72

вакцинації не можна давати тваринам лікарських речовин, які б діяли на вакцинний штам;

при розчиненні й застосуванні вакцини слід обережно використовувати дезречовини.

Контроль живих вакцин

на: - стерильність (вірусні), чистоту й типовість росту (бактеріальні вакцини) – висівом на поживні середовища;

-нешкідливість – введенням лабораторним тваринам;

-активність (імуногенність) – вакцинацією тварин із подальшим їх зараженням польовим штамом.

Живі (неослаблені) вакцини

Ці вакцини були першими, які використовували з метою профілактики інфекційних захворювань у тварин (віспа, перипневмонія великої рогатої худоби), хоч їх збудники ще не були відкриті. У цьому разі використовували вірулентні штами, які вводили

несприйнятливому до них виду (наприклад, збудником віспи корів щепили

овець), або ж вводили його у кінчик хвоста (у так звану «заборонену ділянку»), звідки він поширювався по організму.

На початку XX століття широко використовували симультанне щеплення проти чуми. У цьому разі в одне місце тіла тварини вводили специфічну сироватку, а в інше – вірулентний збудник чуми. Використовували її у неблагополучних господарствах. Щеплення живими вакцинами з вірулентних штамів збудника створює найбільш напружений імунітет, але це завжди загрожує розвитком інфекційної хвороби.

Тому в даний час імунізацію неослабленими штамами застосовують лише з метою профілактики віспи у вигляді віспяного детриту великої рогатої худоби і голубиного штаму віспи птахів.

Для одержання вірусної лімфи, в якій знаходиться природний вірус віспи великої рогатої худоби, використовують телят. Відібраних клінічно здорових тварин фіксують, голять шкіру черева. На шкірі роблять надрізи або 100-120 проколів, через які вносять маточну вакцину. Протягом – 4 – 5 днів на їх місці розвиваються міхурці, із яких відбирають лімфу. Лімфу заливають 80%-м гліцерином, витримують при кімнатній температурі й проводять ліофілізацію. Вірус вакцини проти віспи птахів одержують вирощуванням голубиного штаму на хоріоалантоїсній оболонці ембріонів курей. Одержану масу також висушують ліофільно.

73

Ліофілізація (сублімаційне висушування, ліофільне висушування). Це

висушування в умовах глибокого вакууму з попереднім заморожуванням біопрепаратів. Заморожування здійснюють після розфасування вакцин в ампули при температурі – 40 – 50°С, щоб уникнути фази кристалізації. Після цього відбуваються сублімація (лід перетворюється в пару) при тиску 2 10-4мм рт. ст. і досушування при температурі +20°С. При висушуванні використовують різні захисні середовища – сахарозу, желатину, нативну сироватку, знежирене молоко. Залишкова вологість становить 1 – 3%.

Ліофілізація дає змогу значно збільшити термін придатності препарату, краще зберегти його властивості, на нього менше впливає температурний режим зберігання, значно підвищується концентрація активної речовини, що дає змогу зменшити дозу ін'єкції. Зменшується кількість тари для транспортування.

Інактивовані вакцини

Поняття “інактивований” належить до життєздатності мікроорганізму, який входить до складу вакцини. Їх готують або з цілих вірулентних мікроорганізмів, інактивованих фізичним чи хімічним методами, або з токсичних продуктів, інактивованих до стану анатоксинів.

Важливою умовою ефективності вакцин є підбір інактиватора й оптимальних умов інактивації, які дозволяють залишити збудник інфекційності при максимальному збереженні антигенності.

Частіше всього мікроорганізми інактивують формаліном, який додають у кількості 0,2 – 0,5% для бактеріальних вакцин і 0,05 – 0,1%

– для вірусних; хінозолом 0,01%-м, фенолом до 0,5%; аніліновими фарбами (кристалвіолет) – 0,05%-м; високою температурою.

Серед перших інактивованих вірусних вакцин були вакцини проти сказу, ящуру, класичної чуми свиней, чуми м’ясоїдних, Нюкаслської хвороби та віспи.

Інактивовані вакцини нешкідливі для тваринного організму, проте їх імуногенність у порівнянні з живими значно нижча, а тривалість імунітету значно коротша. Для підвищення імуногенності інактивовані вакцини вводять в організм тварини в більшій кількості, ніж живі, ослаблені, кілька разів (два, три), з інтервалом у 7 – 14 днів.

Для підвищення імуногенної активності бактеріальних і вірусних вакцин і зменшення кратності вакцинації використовують різні

ад'юванти. Вперше їх використав французький вчений Рамон у 1925 р.

74

Ад'юванти

Це хімічні речовини, що впливають на імунологічні реакції за рахунок швидких морфологічних і біохімічних змін в імунізованому організмі. З неорганічних речовин найчастіше використовують алюмінію гідрат оксиду, кальцію фосфат, алюмокалієвий галун; з органічних – мінеральні масла, мурамілпептид, сапонін, гліцерин, агар, желатину, скипидар.

Для посилення імуногенності при отриманні діагностичних сироваток широко використовується ад'ювант Фрейнда – суміш мінерального масла, ланоліну, емульгатора, води та домішок інактивованих мікобактерій туберкульозу.

При використанні ад'ювантів відбувається:

а) депонування антигену за рахунок утворення запальної гранульоми чи фіброзної капсули, де вакцина зберігається близько 7 – 8 тижнів, поступове розсмоктування антигену з депо створює умови для його дії за принципом сумації подразнення, що аналогічно багаторазовому введенню антигену з короткими інтервалами;

б) стимуляція фагоцитозу, що пояснюється утворенням стійких фізико-хімічних зв'язків між частинками антигену на молекулах ад'юванту (корпускулювання). У цьому разі збільшуються розмір і маса окремих частинок (1,8 – 30 мкм). Частинки таких розмірів легше й швидше фагоцитуються макрофагами;

в) посилення розмноження лімфоцитів у зв'язку з виникненням в організмі асептичного запалення.

Інактивовані вірусвакцини виготовляють із тканин і органів заражених тварин, тканин курячих ембріонів або лабораторних тварин, заражених відповідним вірусом. Вірусну біомасу одержують також на перещепленій культурі тканини. Тканини гомогенізують, розбавляють буферним розчином і інактивують – обробляючи формаліном, фенолом, кристалвіолетом, чи ін.

Анатоксини

Токсини – отруйні речовини тваринного, рослинного та мікробного походження – не що інше, як низько- і високомолекулярні білки. Різниця між мінеральними отрутами і токсинами та, що останні

– імуногенні.

Анатоксини – нешкідливі деривати токсинів, які втратили токсичність під впливом фізичної чи хімічної дії і зберегли у цьому разі антигенні та імуногенні властивості.

75

Проблему знезараження токсинів із збереженням їх імуногенності розв'язав Рамон в 1923 р. Діючи на дифтерійний токсин формаліном в умовах тривалого витримування його в термостаті при температурі 39 – 40°С, він одержав препарат із зовсім новими властивостями. Пізніше за таким методом були виготовлені правцевий анатоксин, ботуліновий, стафілококовий, газової гангрени, брадзоту й ентеротоксемії овець.

Механізм утворення анатоксинів до цього часу не встановлений, тому що не вивчена будова самих токсинів. Вважають, що формалін з'єднується з вільними аміногрупами білків, поліпептидів і амінокислот, які зумовлюють отруйні властивості токсинів. Зв'язок утворюється швидко у нейтральному чи слаболужному середовищі при температурі 30 – 40°С.

Вимоги до анатоксинів:

нешкідливість (для перевірки двом морським свинкам вводять анатоксин, протягом місяця у них не повинно бути ознак інтоксикації);

стабільність (витримують високу температуру заморожування, відтавання);

необоротність (ніякі хімічні, фізичні, біологічні впливи не повинні повернути початкову токсичність);

активність (визначається імуногенністю на лабораторних тваринах).

Наприклад, імунізована правцевим анатоксином морська свинка повинна протистояти 200 смертельним дозам правцевого токсину.

Хімічні вакцини

Їх готують із мікробних клітин, виділяючи основні антигени методами екстрагування, кислотного гідролізу чи ферментативного перетравлення з подальшим осадженням антигену.

Специфічні властивості молекули антигену виражаються його антигенними детермінантами, які складаються із 11-20 амінокислотних залишків. Зазначений метод одержання хімічних вакцин ґрунтується на синтезі кілець амінокислот, які аналогічні таким в антигенних детермінантах. Однак такі препарати мають низьку імуногенність. Для її підсилення до олігопептидних ланцюжків приєднують поліелектроліти (полі-4-вінілпіридин та ін.), які можуть виконувати роль Т-лімфоцитів при розвитку імунологічної відповіді на вакцину в організмі (Петров Р. В., Хаїтов Р. М., 1988).

76

Генно-інженерні вакцини

Використання нових біотехнологічних підходів із застосуванням генної інженерії, відкриває широкі перспективи для створення принципово нових вакцин. Генна інженерія являє собою систему експериментальних прийомів, які дають змогу лабораторним шляхом створювати штучні генетичні структури у вигляді так званих рекомбінатних (гібридних) молекул ДНК.

Більшість розроблених чи створених генно-інженерних вакцин є

противірусними (проти ящуру, сказу, грипу).

Проблема їх одержання зводиться до синтезу імунологічноактивних вірусних білків у двох системах: суспензії мікроорганізмів чи культурах тваринних клітин, або безпосередньо в імунізованому організмі.

Утворення віруснейтралізуючих антитіл у більшості вірусів індукує лише білок оболонки. Ген-вірус, який кодує білок, вводять до

геному клітини реципієнта (бактерії кишкової палички, дріжджі, клітини

ссавців). У цьому разі, крім своїх білків, клітина також синтезує і вірусний білок. Його використовують як імуногенний препарат. Крім цілих вірусних білків, таким же методом одержують короткі амінокислотні ланцюжки цих білків, що мають властивості антигенних детермінант.

Щоб синтезувати вірусний білок безпосередньо в імунізованому організмі, проводять заміну частини генома вірусу вірусвакцини на ген вірусного білка. Одержаний генетичний гібрид зберігає властивості розмножуватися в організмі тварин і культурі клітин. Він вважається авірулентним і ефективним проти того вірусу, ген якого введений у ДНК вірусу вірусвакцини.

Так само можуть бути використані й бактеріальні клітини. За допомогою цього методу виготовлено вакцини проти сказу та везикулярного стоматиту.

Генно-інженерні вакцини повинні відповідати стандарту за чистотою, нешкідливістю для тварин і ефективністю. Чистоту визначають за генотипним аналізом, аналізом РНК, послідовністю амінокислот; нешкідливість – відсутністю ознак інтоксикації чи захворювання; ефективність – імуногенністю на лабораторних тваринах.

77

ЛІКУВАЛЬНІ ПРЕПАРАТИ

СИРОВАТКИ ЛІКУВАЛЬНО-ПРОФІЛАКТИЧНІ

Берінг і Кітаза-то (1890), Ру й Віланд (1893) встановили, що сироватка крові піддослідних тварин, імунізованих токсином правцю (ослабленим трихлористим йодом), має властивість нейтралізувати цей токсин. Одержана сироватка мала лікувальний ефект при введенні в

організм хворої на правець тварини.

Це наукове відкриття і лежить в основі виготовлення лікувальнопрофілактичних сироваток. Їх одержують із сироватки крові тварин, гіперімунізованих бактеріальними або ж вірусними антигенами

(живими чи інактивованими мікроорганізмами, анатоксинами, чи чужорідними

тваринам білками). До лікувально-профілактичних сироваток належать

сироватки реконвалесцентів (одержані від тварин, що перехворіли на інфекційні захворювання) та гіперімунні сироватки, які містять значну

кількість специфічних антитіл.

Гіперімунні сироватки готують шляхом гіперімунізації тварин – багаторазовим із нарощуванням кількості введенням тваринам антигену для максимального імунізаторного подразнення, яке проявляється нагромадженням у крові значної кількості специфічних антитіл.

Усі лікувально-профілактичні сироватки, що використовують у ветеринарній медицині, можна розподілити на антибактеріальні, антивірусні, антитоксичні. В усіх випадках єдиним способом їх одержання є імунізація тварин. Антибактеріальні сироватки мають більш виражений лікувально-профілактичний ефект, ніж антивірусні, що пов'язано з внутрішньоклітинним типом паразитування вірусів, де вони стають недосяжними для антитіл.

Після введення в організм реципієнта дія сироватки розпочинається через 2-4 год. і продовжується 8-15 діб. При подальшому введенні сироватки тривалість її дії скорочується, особливо якщо сироватка, одержана на гетерологічних видах тварин. Це зумовлено появою у реципієнта антитіл на чужорідний білок, що може проявлятися патологічною імунною реакцією (сироваткова

хвороба).

Основні вимоги до імунних сироваток:

високий титр специфічних антитіл, що визначає їх активність;

максимальне очищення одержаних сироваток від баластних

78

речовин.

Високої активності сироватки досягають застосуванням високоімуногенних і очищених антигенів для імунізації тварин, розробленням найбільш ефективних схем і методів імунізації, підбором відповідних продуцентів.

Антигени повинні мати високу імуногенну активність при невисокій їх токсичності. Антигенна активність підвищується при більшій їх кількості на одиницю об'єму препарату, або ж маси тварин. Однак підвищення антигенної активності відбувається до відповідного рівня, який є різним для різних антигенів і продуцентів. При надмірно високій дозі антигену може виникати так званий «імуногенний параліч», тобто стан, коли організм продуцента стає ареактивним до будь-якої більшої дози антигену.

Вимоги до тварин – продуцентів сироваток:

велика маса (велика кількість сироватки);

висока реактивність (продукувати активні сироватки);

зручність для догляду.

Для одержання лікувально-профілактичних сироваток гіперімунізують дорослих коней, волів, ослів, овець. Використання коней для одержання сироваток економічно вигідно і зумовлене тим, що їх організм має унікальну властивість – відповідати на гіперімунізацію різними антигенами, утворенням великої кількості специфічних антитіл. Від коней при кожному кровопусканні можна взяти велику кількість крові для одержання сироватки, їх легко доглядати.

Тварин на біофабрики закупляють лише із благополучних господарств. Надалі їх витримують на карантині протягом 90 днів, досліджуючи на різні хвороби (туберкульоз, сап, бруцельоз та ін.). Тварин добре доглядають, повноцінно годують, вигулюють, чистять. Після закінчення терміну використання туші продуцентів утилізують.

ПРОТИЯЩУРНИЙ ІМУНОЛАКТОН

Особливе місце у профілактиці ящуру займає протиящурний імунолактон. Він являє собою спеціально висушений компонент сироватки молока корів із умістом антитіл проти певного серотипу вірусу ящуру, який використовують для внутрішньовим'яної імунізації. На вигляд це білий чи жовтий порошок.

Внутрішньовим'яна імунізація корів-продуцентів ґрунтується на тому, що при внутрішньоцистернальному введенні антигену він у

79