трансплантация / Transplant_3-2009_block_web(1)_2статьи_по_гумор_отторж

НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ

1

	4			13	14
			3
2		5			11
9			10		12

6

7

8

Рис. 1. Аппаратно-программный комплекс, использовавшийся в экспериментах: 1 – осветительная система микроскопа; 2 – шаговые двигатели, перемещающие препаратоводитель по X-, Y-, Z-осям; 3 – экспериментальный резервуар на препаратоводителе; 4 – пара захваченных в оптическую ловушку микроскопических объектов, находящихся в экспериментальном резервуаре; 5 – рабочий объектив микроскопа; 6 – CCD-камера; 7 – компьютер, управляющий шаговыми двигателями, фазовым модулятором и CCD-камерой; 8 – джойстик; 9, 10 – зеркала; 11 – телескоп; 12 – оптическийпространственныйфазовыймодулятор; 13 – фемтосекундный лазер (частота повторения импульсов 1 кГц – оптический скальпель); 14 – непрерывныйиттербиевыйволоконныйлазерилифемтосекундный лазер (частота повторения 80 МГц – оптический пинцет)

таких систем упоминали и мы [1], а также другие отечественные исследователи [2]. Для реализации оптического захвата и манипулирования биообъектами использовалось как непрерывное излучение иттербиевого волоконного лазера (PYL-10-P, IPG Laser GmbH), так и излучение фемтосекундного им- пульсно-периодического лазера с активной средой хром-форстерита, генерирующего импульсы длительностью 100 фс на длине волны 1240 нм с частотой повторения 80 МГц и средней мощностью 200 мВт (CrF-65P, ООО «Авеста проект»).

В качестве оптического лазерного скальпеля используетсяотечественнаяфемтосекунднаяволоконная лазерная система (TETA-10/100 ООО «АвестаПроект») с излучением на длине волны 1,028 мкм, частотой повторения 10 кГц, длительностью импульсов менее 300 фс и энергией более 100 мкДж. Также в лазерной системе существует возможность перестройки частоты излучения в видимый и УФдиапазоны спектра путем генерации оптических гармоник. Достоинством данной системы является простота в эксплуатации, высокая надежность, меньшая критичность к изменению температурного режима по сравнению с традиционными фемтосекундными лазерами с керровской нелинейностью.

Оптический захват биообъектов осуществлялся с использованием инвертированного биологическо-

го микроскопа (МИБ-Р, ЛОМО). Для фокусировки излучения использовались объективы с различной числовой апертурой: М-ФЛЮАР 40х/0,85 Л, ЛОМО М-ФЛЮАР 100х/1,2 Л МИ, М-ФЛЮАР 100х/1,3 Л

МИ(ЛОМО). Разработаннаясистемапозволялаформировать как одну, так и несколько (до 4 в описываемом эксперименте) оптических ловушек.

Для формирования множества оптических ловушек имеется оптический пространственный фа-

зовый модулятор (HEO 1080P II, Holoeye Photonics AG). Благодаря специальному программному обеспечению, управляющему модулятором, ловушки могут интерактивно перемещаться по трем координатам в растворе независимо друг от друга. Таким способом можно прецизионно перемещать и ориентировать объекты друг относительно друга в одном поле зрения микрообъектива. При этом также можно было синхронно перемещать все множество захваченных объектов на значительные расстояния (более 1 мм) из одного поля зрения в другое благодаря смещению среды (кюветы), в которой находятся объекты. Для перемещения кюветы со средой во всех экспериментах использовался трехкоординатный манипулятор с шаговыми двигателями и минимальным шагом перемещения 1,25 мкм. Скорость перемещения можно контролировать специальным компьютерным обеспечением, управляющим манипулятором, вдиапазонеот2,5 до700 мкм/с. Удержание объекта в оптической ловушке можно визуально контролировать с помощью CCD-камеры.

В данной работе представлены результаты измерений максимальной скорости перемещения биологического объекта в зависимости от интенсивности лазерного излучения. В качестве биологического объекта в работе использовалась известная клеточ-

ная линия Chinese hamster ovary (СНО) [23]. Резуль-

таты эксперимента представлены на рис. 2.

Рис. 2. Зависимость максимальной скорости манипулирования клетками с разным диаметром (1 – 18 мкм, 2 – 16,1 мкм, 3 – 15,6 мкм, 4 – 13,8 мкм, 5 – 13,9 мкм, 6 – 8,9 мкм) от плотности мощности излучения в оптической ловушке

109

ВЕСТНИК ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ		том XI	№ 3–2009
На графике видно, что все кривые (для клеток	шее исследование подтвердило наличие значитель-
разного диаметра) можно условно разбить на два	ноговарьирования максимальной скоростиманипу-
участка. На первом скорость линейно зависит от	лирования от клетки к клетке при близких размерах
интенсивности лазерного излучения, а на втором –	последних. В работах [5, 6] показана возможность
увеличение интенсивности не приводит к увеличе-	манипулирования	внутриклеточными	структура-
нию скорости движения объектов. Одной из причин	ми. В случае преломления света на этих структурах
ограниченияскоростиманипулирования, возможно,	происходитизменениесуммарнойоптическойсилы,
является наличие у мембраны предела прочности.	действующей на клетку. При этом изменяется вели-
То есть при достижении определенного порогового	чина максимальной скорости перемещения клетки.
значенияинтенсивностиоптическая ловушкавпро-	Исследуемые клетки СНО характеризуются высо-
цессе увеличения скорости движения клетки (когда	ким ядерно-цитоплазматическим соотношением
происходит рост силы вязкого сопротивления) мо-	[9]. Поэтому большого вклада в вариации скорости
жет создать на ограниченной площади ее мембраны	манипулирования клетками ядро, вероятно, давать
(диаметром менее 2 мкм) давление, превышающее	не будет. Однако при рассмотрении цитоплазмы
прочность мембраны.	большинства клеток СНО в проходящем свете об-
В соответствии с выражением (1) при увеличе-	ращает на себя внимание наличие множества гра-
нии диаметра клетки возрастает сила вязкого тре-	нуловидных внутриклеточных структур, которые от
ния, иследовательно, необходимоувеличиватьсилу	клетки к клетке отличаются размерами, количест-
оптического захвата путем увеличения интенсив-	вом, положением и связью с цитоскелетом. Серию
ности лазерного излучения для сохранения макси-	клеток, на которых производили измерение мак-
мальной скорости перемещения. График отражает	симальной скорости манипулирования, подвергли
тенденцию, подтверждающую этот тезис. Кроме	оптической томографии. Сделано 20 срезов каждой
того, несмотря на незначительную разницу разме-	клетки с использованием оптики, формирующей
ров некоторых клеток, например кривые 4 и 5, зна-	фазово-контрастное изображение среза (толщиной
чения максимальной скорости их манипулирования	1–2 мкм) (рис. 3). Нафотографияхаибизображены
значительно отличаются (почти в 2 раза). Дальней-	два среза одной клетки, где на а в срезе наиболее

g

N N

а

б

	N		N
			Рис. 3. Наиболее яркие ва-
	g		риации во внутриклеточной
			морфологической и опти-
			ческой организации клеток
в		г
			СНО

110

НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ

четко в фокусе находится ядро (N), а на б – одиноч-
ное скопление мелких грануловидных структур (g),
создающих оптическую неоднородность в цитоп-
лазме клетки правее и выше ядра. На фотографии в
виден срез другой клетки, в котором можно видеть
одиночную крупную грануловидную структуру (g),
ядро – правее, ниже и вне плоскости фокуса; г – фо-
тография среза одной из исследованных клеток, в
которой грануловидные внутриклеточные структу-
ры расположены гирляндой (черные стрелки), опо-
ясывающей ядро.
Рассмотрим поведение клетки и внутриклеточ-
ных грануловидных структур при воздействии оп-
тической ловушки. Когда клетка была прикреплена
ко дну, при направлении пучка лазера оптического	Рис. 4. Кривые зависимости максимальной скорости
пинцета на эти структуры перемещать их не удава-
лось в большинстве случаев. Это свидетельствует о	манипулирования шванновскими и			СНО-клетками
	от их диаметра при плотности мощности излучения
том, что чаще всего они привязаны цитоскелетом к	2,3 · 106 Вт/см2. Каждому значению диаметра соответс-
определенному месту в клетке. Однако если клетка	твует 10 значений максимальной скорости манипулиро-
свободна, то гранулы стремились занять опреде-	вания различных клеток (отражено в величине стандар-
ленное место относительно оптической перетяжки,	тных ошибок на графике)
разворачивая клетку необходимым образом. Клетка
при этом уравновешивается относительно оптичес-	данныевкорнеотличалисьотрезультатов, получен-
кой перетяжки несимметрично, чего бы не было	ных для клеток CHO такого же размера, в которых,
при абсолютной ее оптической однородности. Зна-	очевидно, имело место попадание в область про-
чит при взаимодействии пучка света, проходящего	хожденияпучкасветавнутриклеточныхоптических
через клетку с грануловидными структурами, воз-	неоднородностей. Если проходящий внутри клетки
никают дополнительные оптические силы. Внут-	свет попадает на эти структуры, то в целом угол
риклеточные структуры отличались чрезвычайным	преломления, направленного на клетку пучка све-
разнообразием размеров, количества, места поло-	та, изменяется, а следовательно, изменяется и сила,
жения и связью с цитоскелетом, что может влиять	действующая на клетку. Предсказать расположение
на их вклад в конечную оптическую силу, действу-	этих элементов в клетке, их морфологические и оп-
ющую на клетку. Для дополнительного испытания	тические характеристики в процессе эксперимента
последнего был проведен эксперимент на клетках,	непредставляетсявозможным, поэтомуполучаемые
характеризующихся схожим высоким ядерно-ци-	значения максимальной скорости манипулирования
топлазматическим соотношением, но менее выра-	сильно различаются, и это находит отражение в пи-
женной внутриклеточной оптической неоднород-	лообразном характере полученной кривой. Кривая,
ностью, отмеченной в клетках СНО. Примером	полученная для клеток ганглия, позволяет сделать
таких клеток являются шванновские клетки млеко-	и другой важный вывод. Наличие выраженных оп-
питающего. Была приготовлена органотипическая	тических неоднородностей, по-видимому, являет-
культура спинального сенсорного ганглия млеко-	ся свойством опухолевой линии СНО, поскольку в
питающего, техника и методы работы с клетками	клетках, приготовленных по протоколу шваннов-
которой, а также методы очистки были разработа-	ской клетки, такой выраженной гранулярности не
ны для шванновских клеток млекопитающих ранее	наблюдалось. В связи с последним, как мы увидели
[10, 14, 21]. Пример типичной кривой зависимости	на графике, имеет место минимальное варьирова-
максимальной скорости манипулирования шван-	ние значений максимальной скорости перемещения
новскими клетками от их диаметра, полученной в	клеток (по крайней мере, для клеток, размер кото-
ходеэкспериментовприпостояннойинтенсивности	рых лежит в диапазоне 13,4–16,6 мкм). То есть для
излучения в оптической перетяжке 2,3·106 Вт/см2,	шванновских клеток значение максимальной скоро-
приведен на рис. 4. Для сравнения на этом же ри-	сти манипулирования при данной плотности мощ-
сунке приведена аналогичным образом полученная	ности излучения в оптической ловушке – величи-
кривая для клеток СНО, характеризующихся схо-	на, близкая к постоянной. Соответственно, можно
жими размерами.	сделать предположение, что типичные клетки мле-
Разброс значений максимальной скорости мани-	копитающих, характеризуемые узким диапазоном
пулирования для шванновских клеток в диапазоне	варьирования размеров клеток, высоким ядерно-
диаметров13,4–16,6 мкмнепревышал10 мкм/с. Эти	цитоплазматическим соотношением,			не имеющие

111

ВЕСТНИК ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ	том XI № 3–2009

ярких оптических неоднородностей (наблюдаемых, например, у клеток СНО), будут обладать схожим постоянством значений максимальной скорости манипулирования от клетки к клетке для данного вида клеток. Если это оправдается и максимальная скорость манипулирования будет типичной для заданной интенсивности для данного вида клеток, то, устанавливая параметры и условия оптимального манипулирования клетками разных видов, мы сможем создавать рекомендации для дальнейших работ в сфере тканевой инженерии. Данная работа, в частности, показала, что при плотности мощности излучения I ≈ 9,7 · 105 Вт/см2 максимальная скорость манипулирования шванновскими клетками состав-

ляла υmax ≈ 10 ± 1,5 мкм/с, при I ≈ 1,6 · 106 Вт/см2 – υmax ≈ 19 ± 4 мкм/c, при I ≈ 2,3 · 106 Вт/см2 – υmax ≈

46 ± 6 мкм/c. Необходимо отметить, что эти значения были получены для клеток, диаметры которых отличались не более чем на 20%. Для клеток СНО в данном диапазоне размеров значения максимальной скорости манипулирования варьировались от 15 до 85 мкм/c (измеренные значения). Измерения для обоих видов клеток проводились с использованием объектива М-ФЛЮАР 40х/0,85 Л.

Результаты экспериментов показали, что при проведении прецизионного ориентирования клеток в пространстве и относительно друг друга при решении тех или иных клеточно-хирургических задач требуется учитывать, что на пути прохождения пучка света, формирующего оптическую ловушку, могут попадаться разнообразные внутриклеточные структуры. Последнее может приводить к изменению манипулируемости клеткой и нарушению предполагаемого поведения клетки в области оптической ловушки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы создан про- граммно-аппаратный комплекс оптического фемтосекундного лазерного пинцета-скальпеля, позволяющий осуществлять лазерное воздействие и трехмерное оптическое манипулирование биологическими объектами в диапазоне размеров от нескольких сотен нанометров до нескольких десятков микрометров. С помощью оптического пространственного фазового модулятора и специального программного обеспечения система позволяет интерактивно перемещать независимо друг от друга и прецизионно ориентировать в одном поле зрения множество биологических объектов (на протяжении десятков микрометров). Также существует возможность синхронно перемещать все захваченные объекты из одного поля зрения в другое на значительные расстояния (более 1 мм) путем смещения среды, в которой они находятся. Используя специ-

альноепрограммноеобеспечение, можноконтролировать скорость перемещения среды относительно объектов или самих объектов, а также наблюдать и регистрировать взаимодействие оптической ловушки с биологическим объектом. Это позволяет изучать механизм и параметры оптического манипулирования биологическими объектами.

Проведено исследование оптического манипулирования СНО-клеток. Установлено, что при увеличении интенсивности излучения лазера в определенном диапазоне наблюдается линейное увеличение максимальной скорости манипулирования клеткой. При достижении определенного значения интенсивности дальнейший ее рост не приводит к увеличению максимальной скорости движения. Обнаружен значительный разброс максимальной скорости манипулирования клетками СНО от клетки к клетке при близких размерах последних. Это, вероятно, связано с наличием во многих клетках этого вида оптических неоднородностей – грануловидных внутриклеточных структур, которые от клетки кклеткеотличаются размерами, количеством, положением и связью с цитоскелетом.

Проведено измерение максимальной скорости манипулирования одного из видов глиальных клеток нервной ткани млекопитающего – шванновской клетки (клетки были получены из сенсорного ганглия млекопитающего и очищены по протоколам, ранее разработанным для шванновских клеток млекопитающих). Варьирование максимальной скорости манипулирования от клетки к клетке при близких размерах последних, равно как и разбросы значений этой скорости шванновских клеток в диапазоне диаметров 27–33 мкм не превышали 10 мкм/с. Таким образом, клетки спинального ганглия характеризуются большей оптической однородностью по сравнению с клетками СНО. Измерены значениямаксимальнойскоростиманипулирования шванновскими клетками при различных интенсивностях лазерного излучения оптического пинцета.

Выполненные эксперименты показали, что при проведении прецизионного ориентирования клеток в пространстве и относительно друг друга при решении тех или иных задач клеточной хирургии требуется учитывать, что внутриклеточные оптические неоднородности могут попадать в область оптической ловушки. В результате этого изменяется максимальная скорость манипулирования клеткой и ориентация клетки относительно оптической ловушки.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.РакитянскийМ.М.,АгранатМ.Б.,АшитковС.И. и др.

Фемтосекундный лазерный «пинцет-скальпель» для захватаиманипулированиянанообъектами, оптичес-

112

НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ

кой микро-нанохирургии и тканевой инженерии // Тезисы международного форума по нанотехнологи-

ям Rusnanotech. М. 2008.

2.Саркисов О.М. Перспективы применения голографического пинцета и скальпеля как наноинструмента биомедицинских технологий // Тезисы международного форума по нанотехнологиям Rusnanotech. М. 2008.

3.Ashkin A., Dziedzic J.M., Bjorkholm et al. Observation of a single beam gradient trap for dielectric particles // Opt. Lett. 1986. № 11. Р. 288–290.

4.Ashkin A., Dziedzic J.M. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria // Science. 1987. Vol. 235 (4795). Р. 1517–1520.

5.Ashkin A., Dziedzic J.M. Internal cell manipulation using infrared laser traps // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. Vol. 86 (20). Р. 7914–7918.

6.Ashkin A., Schutze K., Dziedzic J.M. et al. Force generation of organelle transport measured in vivo by an infrared laser trap // Nature. 1990. Vol. 348 (6299). Р. 346–348.

7.Ashkin A. Forces of a single-beam gradient laser trap on a dielectric sphere in the ray optics regime // Biophys. J. 1992. Vol. 61. Р. 569–582.

8.Oraevsky A.A., Luiz B. et al. Plasma Mediated Ablation of Biological Tissues with Nanosecond-to-Femtosecond Laser Pulses: Relative Role of Linear and Nonlinear Absorption // IEEE J. of selected topics in quantum electronics. 1996. Vol. 2. № 4.

9.Brunsting A. and Mullaney P.F. Differential light scattering from spherical mammalian cells // Biophys. J. 1974. Vol. 14. Р. 439–453.

10.Breckes J.P., Fields K.L. and Raft M.C. Studies on cultured rat Schwann cells. I. Establishment of purified populations from cultures of poripheral nerve // Brain Res. 1979. Vol. 165. Р. 105–118.

11.Curtis J.E., Koss B.A. & Grier D.G. Dynamic holograph-

ic optical tweezers // Opt. Commun. 2002. Vol. 207. Р. 169–175.

12.Harada Y. and Asakura T. Radiation forces on a dielectric sphere in the Rayleigh scattering regime // Opt. Commun. 1996. Vol. 124. Р. 529–541.

13.Hammer D.X., Thomas R.J., Noojin G.D. et al. Experimental investigation of ultrashort pulse laser-induced

breakdown thresholds in aqueous media // IEEE J. Quantum Electron. 1996. Vol. 32. Р. 670–678.

14.Haastert K., Mauritz C., Chaturvedi S. et al. Human and rat adult Schwann cell cultures: fast and efficient enrichment and highly effective non-viral transfection protocol // Nature Protocols. 2007. Vol. 2. № 1. Р. 99– 104.

15.Juhasz T., Kastis G.A., Suarez C. et al. Time resolved observations of shock waves and cavitation bubbles generated by femtosecond laser pulses in corneal tissue and water // Lasers Surg. Med. 1996. Vol. 19. Р. 23–31.

16.Kennedy P.K., Boppart S.A., Hammer D.X. et al. A firstorder model for computation of laser-induced breakdown thresholds in ocular and aqueous media: Part I – Theory and part II – Comparison to experiment // IEEE J. Quantum Electron. 1995. Vol. 31. Р. 2241–2257.

17.Konig K., Tadir Y., Patrizio P. et al. Effects of ultraviolet exposure and near infrared laser tweezers on human spermatozoa // Human Reproduction 1996. Vol. 11. № 10. Р. 2162–2164.

18.Liang H., Vu K.T., Krishnan P. et al. Wavelength Dependence of Cell Cloning Efficiency after Optical Trapping // Biophysical J. 1996. Vol. 70. Р. 1529–1533.

19.Liu Y., Sonek G.J., Berns M.W. et al. Physiological monitoring of optically trapped cells: assessing the effects of confinement by 1064-nm laser tweezers using microfluorometry // Biophys. J. 1996. № 71. Р. 2158–2167.

20.Loesel F.H., Niemz M.H., Bille J.F. et al. Laser-induced optical breakdown on hard and soft tissues and its dependence on the pulse duration: Experiment and model // IEEE J. Quantum Electron. 1996. Vol. 32. Р. 1717– 1722.

21.Porter S., Clark M.B., Glaser L. et al. Schwann cells stimulated to proliferate in the absence of neurons retain full functional capability // J. Neurosci. 1986. № 6. Р. 3070–3078.

22.Schneckenburger Н., Hendinger А., Sailer R. et al. Cell viability in optical tweezers: high power red laser diode versus Nd:YAG-laser // J. of Biomedical Optics. 2000. Vol. 5 (1). Р. 40–44.

23.Uchida M., Sato-maeda M., Tashiro M. Whole-cell manipulation by optical trapping // Current Biology. 1995. Vol. 5. № 4. Р. 380–382.

113

ВЕСТНИК ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ	том XI № 3–2009

ПОЗДНЯЯ ДИСФУНКЦИЯ ТРАНСПЛАНТИРОВАННОЙ ПОЧКИ: ПРИЧИНЫ, МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА, ПОДХОДЫ К ПРОФИЛАКТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ

Столяревич Е.С., Томилина Н.А.

ФГУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ, Москва

В статье приводятся морфологические характеристики основных причин поздней дисфункции трансплантированной почки, таких как острое и хроническое отторжение, нефротоксичность ингибиторов кальцинейрина и неспецифический фиброз интерстиция и атрофия канальцев, а также рассматриваются возможные подходы к их профилактике и лечению путем модуляции иммуносупрессивной терапии (ИСТ). В частности, анализируются литературные данные об эффективности конверсии с циклоспорина на такролимус при остром позднем отторжении, а также перехода на ИСТ на базе ингибиторов пролиферативного сигнала (сиролимус, эверолимус) при нефротоксичности, индуцированной ингибиторами кальцинейрина.

Ключевые слова: трансплантация почки, поздняя дисфункция трансплантата, иммуносупрессивная терапия

LATE DYSFUNCTION OF THE GRAFTED KIDNEY: CAUSES, MORPHOLOGICAL STRUCTURE, PROPHYLAXIS AND TREATMENT

Stolyarevich E.S., Tomilina N.A.

Academician V.I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs, Moscow

The most important causes of late renal graft dysfunction (late acute rejection, chronic rejection, chronic nephrotoxicity induced by calcineurin inhibitors (CNI) and nonspecific nephrosclerosis), their morphological characteristics and the current approaches to their treatment are considered. One of the ways to influence the prevention and the course of late acute rejection which is under discussion in literature is the conversion from cyclosporine A to tacrolimus. The switch from standart to low dosage cyclosporine in combination with proliferative signal inhibitors (sirolimus, everolimus) is considered as a way to prevent the progression of nephrosclerosis due to CNInephrotoxicity. In cases where the main cause of the late kidney graft dysfunction is nonspecific nephrosclerosis the treatment with ACE-inhibitors and optimization with CNI-dosage may be recommended.

Key words: kidney transplantation, late graft dysfunction, immunosupression

Несмотря на успехи, достигнутые в трансплан-	нальную хроническую почечную недостаточность.
тологии за последние годы, отдаленные результаты	Первоначально этот термин был предложен как
пересадки почки за последнее десятилетие улучши-	морфологическое понятие, объединяющее различ-
лись лишь незначительно. Одной из основных при-	ную патологию трансплантата, основным проявле-
чинотдаленныхпотерьтрансплантированнойпочки	нием которой является нефросклероз, в развитии
является хроническая трансплантационная нефро-	которого принимают участие как антиген-зависи-
патия (ХТН), под которой понимают нефросклероз,	мые, так и неспецифические факторы [48]. В даль-
клинически проявляющийся неуклонным сниже-	нейшем, по мере распространения этого термина в
нием функции трансплантата с исходом в терми-	клинической трансплантологии под ним все чаще

Статья поступила в редакцию 15.06.09 г.

Контакты: Томилина Наталья Аркадьевна, зав. отделением нефрологических проблем трансплантации почки, д. м. н., про-

фессор. Тел. [phone], e-mail: [e-mail].

114

		НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
стали понимать стойкую, медленно прогрессирую-	(NIH) и Cooperative Clinical Trial in Transplantation
щую дисфункцию трансплантата без уточнения ее	(ССТТ) [10, 11], в целом использует те же критерии
морфологической картины. Тем не менее морфоло-	острого отторжения, что и Banff-классификация,
гическая верификация диагноза в таких случаях яв-	однако имеются некоторые различия в структуре
ляется единственной возможностью провести диф-	патологии позднего посттрансплантационного пе-
ференциальную диагностику между целым рядом	риода. В частности, в ней учитывается возвратная
различных патологий, имеющих сходные клиниче-	и de novo гломерулярная патология, состояния, свя-
ские проявления, но принципиально различных по	занные с продукцией антител к антигенам, не свя-
своей природе и требующих различных, зачастую	занным с МНС, и целый ряд других осложнений.
противоположных, подходов к ведению пациентов.		Такимобразом, насегодняшнийденьвморфоло-
Таким образом, на сегодняшний день пункционная	гическойструктуредисфункциитрансплантирован-
биопсия является «золотым стандартом» диагнос-	ной почки выделяют 3 основные группы:
тики патологии трансплантированной почки, и про-	1) патология, связанная с отторжением, к которой
ведение ее необходимо во всех случаях развития		относится острое и хроническое отторжение
поздней дисфункции трансплантата для уточнения		трансплантата;
ее природы и определения подходов к лечению.	2)	патология, не связанная с отторжением;
Представления о критериях морфологической диа-	3)	возвратная и de novo патология.
гностики причин дисфункции трансплантирован-		При этом практически все вышеперечисленные
ной почки в значительной степени изменялись по	варианты патологии трансплантата могут наблю-
мере углубления знаний о механизмах иммунного	даться в поздние сроки после АТП и проявляться
ответа и репарации ткани почки в ответ на повреж-	стойкой, прогрессирующей дисфункцией транс-
дение как иммунного, так и неиммунного характе-	плантата.
ра. Эта эволюция нашла отражение в изменениях
классификации патологии почечного транспланта-	ОСТРОЕ ОТТОРЖЕНИЕ
та. На сегодняшний день наиболее широко исполь-
зуется классификация патологии почечного транс-		Под отторжением трансплантата понимают па-
плантата: одна из них была принята в городе Banff	тологический процесс, который возникает в до-
в 1993 г. и в дальнейшем пересмотрена в 1997, 2002	норском органе вследствие специфического ответа
и 2005 гг. [40, 41, 48, 49]. В основу этой классифи-	иммунной системы реципиента на трансплантаци-
кации была положена полуколичественная оценка	онные антигены донора и проявляется острым па-
отдельных элементов повреждения почечной ткани	дением функции пересаженной почки [1–3, 11, 16].
(таких как интерстициальная инфильтрация, тубу-	При этом возможна активация как клеточного, так
лит, интимальный артериит и др.), на основании	и гуморального звена иммунного ответа. В зависи-
которой были сформулированы критерии острого	мости от преобладания одного из этих механизмов
отторжения и выделены различные его варианты.	выделяют два основных варианта острого отторже-
В отношении поздней дисфункции трансплантата	ния трансплантата: клеточно-опосредованное и гу-
в Banff-классификации были предложены критерии	моральное.
хронического отторжения, позволяющие выделять		В основе клеточно-опосредованного (или клеточ-
нефросклероз, развившийся вследствие специфи-	ного) отторжениялежитинфильтрация тканейпочки
ческих иммунных механизмов от нефросклероза	активированными T-лимфоцитами, с повреждением
другой этиологии. При этом в последнем вариан-	различных компонентов почечной паренхимы (ин-
те Banff-классификации, принятой в 2005 г., авто-	терстиций, канальцы, стенка сосудов, клубочки),
ры предлагают отказаться от термина хронической	которые могут быть вовлечены в процесс по отде-
трансплантационной нефропатии, вместо которо-	льности, либо в различных комбинациях. Наиболее
го выделяют несколько возможных причин разви-	часто острое клеточное отторжение протекает с кар-
тия нефросклероза в трансплантате, не связанных	тиной острого тубуло-интерстициального нефрита
с действием антигензависимых факторов. Лишь в	и повреждением стенки канальцев (тубулоинтерс-
случае, когда, несмотря на использование всех воз-	тициальный вариант по ССТТ-классификации или
можностей морфологического и иммуногистохи-	Banff 1). По данным различных авторов, такой ва-
мического исследования, невозможно определить	риант поражения встречается в 45–70% всех случа-
причину развития склеротических изменений, до-	ев [11]. Приэтомотмечаетсядиффузнаяилиочаговая
пустимо использование термина «неспецифичес-	интерстициальная инфильтрация и отек интерсти-
кий тубуло-интерстициальный склероз и атрофия	ция. Тяжесть поражения оценивается по выражен-
канальцев» [49]. Другая широко распространенная	ности тубулита, то есть по количеству лимфоцитов
насегодняшнийденьклассификация, предложенная	в поперечном срезе канальцев при светооптическом
R. Colvin и одобренная National Institutes of Health	исследовании биоптата. Если их менее 4, то можно

115

ВЕСТНИК ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ		том XI № 3–2009
говорить лишь о пограничных изменениях или по-	ценции на С4d-компонент комплемента неотличимо
дозрении на острое отторжение. В зависимости от	от ишемического-реперфузионного повреждения ка-
числа лимфоцитов, инфильтрирующих клеточную	нальцев.
стенку, в Banff-классификации выделяются подтипы	2-й тип проявляется задержкой мононуклеаров и
1а (тубулит 4–10 лимфоцитов на срез канальца) и 1б	нейтрофилов в капиллярах клубочков (гломерулит)
(тубулит >10 лимфоцитов на срез канальца).	или перитубулярных капиллярах (капиллярит).
Более тяжелым вариантом клеточного оттор-	3-й тип характеризуется фибриноидным некро-
жения является сосудистое клеточное отторжение	зом стенок артерий с нарушением их структуры и
(тип 2 по Banff-классификации), характерным при-	явлениями тромбоза.
знаком которого считается интимальный артериит	Несмотря на то что свечение C4d на перитубу-
или инфильтрация лимфоцитами интимы артерий.	лярных капиллярах выявляется от 25 до 50% случа-
Еслиэтоприводитксужениюпросветасосудаменее	ев острого отторжения [43], так называемое «чис-
чем на 25%, то говорят о подтипе 2а, при сужении	тое» гуморальное отторжение является достаточно
сосуда более чем на 25% диагностируется подтип	редкой патологией. Как правило, речь идет о сме-
2б по Banff-классификации. В наиболее тяжелых	шанном варианте отторжения, имеющем черты как
случаях в процесс вовлекается вся сосудистая стен-	клеточного, так и гуморального процесса. При этом
ка, то есть имеет место трансмуральный артериит,	даже если в морфологической картине превалиру-
часто сопровождающийся явлениями фибриноид-	ют признаки клеточного отторжения, то прогноз
ного некроза (Banff 3), однако такое поражение со-	определяется прежде всего наличием гуморального
судистой стенки значительно более характерно для	компонента. Так, поданнымразличныхавторов, по-
гуморального отторжения.	тери трансплантата при клеточном варианте оттор-
В основе развития гуморального отторжения	жения не превышают 4–7%, тогда как при наличии
лежит взаимодействие антидонорских антител	гуморального компонента (С4d+) этот показатель
с антигенами, расположенными на поверхнос-	возрастает до 30–50% [18, 29].
ти эндотелиальных клеток с активацией системы
комплемента и привлечением в очаг повреждения	ХРОНИЧЕСКОЕ ОТТОРЖЕНИЕ
нейтрофилов. Тяжелое повреждение эндотелиаль-
ных клеток в результате активации системы комп-	ТРАНСПЛАНТАТА
лемента приводит к развитию некроза сосудистой	В отличие от острого отторжения этот процесс
стенки и тромбоза. Другим следствием активации	характеризуется	персистирующей, вялотекущей
системы комплемента по классическому пути яв-	иммуннойреакциейсвовлечениемклеточныхи/или
ляется образование С4d-фрагмента системы ком-	гуморальныхмеханизмов, ведущихкпостепенному
племента, который не имеет собственной функци-	развитию и прогрессированию нефросклероза.
ональной активности, но благодаря ковалентному	ОсновноймишеньюприразвитииХОТявляются
связыванию с тканями почки является надежным	эндотелиальные клетки, в связи с этим наиболее ха-
маркером активации гуморального звена иммуни-	рактерными морфологическими его проявлениями
тета и может быть использован для диагностики	являются изменения со стороны капилляров клу-
гуморального отторжения. При этом выявление	бочка, интимы сосудов (артерий) и перитубулярных
свечения С4d на перитубулярных капиллярах, вы-	капилляров.
являемое при иммунофлюоресцентном исследова-	Одним из характерных морфологических при-
нии, тесно коррелирует с появлением антидонор-	знаков ХОТ является хроническая трансплантаци-
ских антител в сыворотке пациента [29]. Таким	онная гломерулопатия (ХТГ), под которой подразу-
образом, острое гуморальное отторжение может	мевают диффузное удвоение контура капиллярных
быть диагностировано и считается достоверным	петель клубочка [15, 30]. В ряде случаев оно может
при наличии трех критериев: фиксация С4d на пе-	сопровождаться расширением мезангия и пролифе-
ритубулярных капиллярах, признаки повреждения	рацией мезангиоцитов с формированием дольчатой
почечной ткани и появление циркулирующих ан-	структурыклубочка. Болеечемвполовиневсехслу-
тидонорских антител [40].	чаев морфологическая картина ХТГ сопровождает-
Приналичиилишь2 изперечисленныхкритериев	ся диффузным свечением C4d на перитубулярных
диагноз считается вероятным, но не достоверным.	капиллярах (по различным данным – от 49 до 66%),
В зависимости от характера повреждения ткани	что свидетельствует о роли гуморального звена им-
почки выделяют 3 типа острого гуморального от-	мунитета в развитии этого процесса.
торжения, отражающие как стадию процесса, так и	Другим характерным морфологическим про-
тяжесть поражения.	явлением ХОТ являются изменения артерий,
1-й тип характеризуется картиной острого ка-	описанные как хроническая трансплантационная
нальцевого некроза и в отсутствие иммунофлюорес-	артериопатия. Под этим термином понимают ха-

116

НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ

рактерное концентрическое утолщение интимы артерий, ведущее к значительному сужению просвета сосудов.

Изменения, касающиеся интерстиция и канальцев при ХОТ, являются характерными, но неспецифичными, и включают фиброз интерстиция и атрофию канальцев – так же, как при нефросклерозе другой этиологии.

Особое значение у пациентов с ХОТ, так же как

ив случаях острого отторжения, имеют данные иммунофлюоресценции, в зависимости от которых выделяют хроническое активное (C4d+) и неактивное (C4d+) отторжение, что, в свою очередь, во многом определяет тактику ведения пациентов при данной патологии. Другим проявлением активности процесса считается сочетание признаков острого и хронического отторжения (активное клеточно-опосредованное хроническое отторжение трансплантата по классификации ССТТ) независимо от свечения C4d. В этом случае терапевтическая тактика определяется тяжестью острого отторжения.

Патология трансплантата, вызванная действием причин, не связанных с отторжением, включает в себя целый ряд патологических процессов, исходом которых является нефросклероз. В Banff-класси- фикации 1993 и 1997 гг. эти варианты поражения трансплантата объединялись под термином «хроническая трансплантационная нефропатия». Однако в последнем варианте Banff-классификации, принятой в 2005 г., авторы предлагают отказаться от этого термина и выделять в качестве возможных причин развития нефросклероза в данной ситуации следующие нозологические формы: гипертонический нефроангиосклероз, вирусное поражение трансплантата, хронический пиелонефрит, обструктивная нефропатия. Лишь в случаях, когда невозможно определить причину развития склеротических изменений, допустимо использование термина «неспецифический тубуло-интерстициальный склероз

иатрофия канальцев» [49].

Основным критерием тяжести поражения трансплантата во всех вышеперечисленных случаях является выраженность фиброза интерстиция и атрофии канальцев, что отражает как тяжесть, так

идавность патологического процесса, независимо от его природы. В соответствии с Banff-класси- фикацией распространенность интерстициальных изменений при нефросклерозе любой этиологии оценивается полуколичественно в зависимости от площади почечной паренхимы, занимаемой участками фиброза интерстиция (СI) и атрофии канальцев (СТ), и расценивается как минимальные

(СI – 6–25% и СТ ≤ 25%); умеренные (СI – 26–50%

иСТ – 26–50%) либо выраженные (СI >50% и СТ > 50%).

НЕФРОТОКСИЧНОСТЬ ИНГИБИТОРОВ КАЛЬЦИНЕЙРИНА (СNI-ТОКСИЧНОСТЬ)

Среди всех причин дисфункции РАТ, не связанных с действием иммунных факторов, нефротоксичность ингибиторов кальцинейрина является наиболее часто встречающейся патологией у пациентов, получающих ИСТ на основе циклоспорина или такролимуса.

В зависимости от сроков и механизмов развития выделяют 3 варианта нефротоксичности CNI.

Остраянефротоксичность– развиваетсяпреимущественно в ранние сроки после АТП у пациентов, получающих высокие дозы и имеющих высокую концентрацию CNI в крови. Изменения канальцевого эпителия характеризуются образованием мелких мономорфных вакуолей в цитоплазме тубулоцитов (изометрическая вакуолизация), возможно также образование микрокальцификатов в стенке канальцев. Поражение артериол проявляется вакуолизацией, а затем и некрозом отдельных миоцитов, возможно также набухание эндотелиальных клеток. Как правило, эти изменения оказываются полностью обратимыми и регрессируют после коррекции дозы препарата [11].

Хроническая нефротоксичность – может развиваться в исходе острой нефротоксичности при сохраняющихся высоких концентрациях CNI, однако чаще хроническая нефротоксичность определяется упациентовбезэпизодовостройнефротоксичности ванамнезеиимеющихконцентрациюэтихпрепаратов в пределах «терапевтического окна». При этом вероятность ее развития определяется прежде всего длительностью приема ингибиторов кальцинейрина. Так, по данным Nankivell, полученным при анализе результатов протокольных биопсий, признаки хронической нефротоксичности CNI втойилииной степени имеются у всех пациентов, получающих эти препараты, через 10 лет после АТП [35]. Основным морфологическим проявлением хронической нефротоксичности является CNI-ассоциированная артериолопатия, характеризующаяся нодулярными (на месте некротизированных миоцитов) либо трансмуральными (по мере прогрессирования процесса) гиалиновыми депозитами на периферии стенки артериол, в сочетании с вторичными изменениями той или иной выраженности (интерстициальный фиброз, атрофия канальцев, глобальный или сегментарный гломерулосклероз). Тяжесть артериолопатии оценивается полуколичественно по выраженности и распространенности артериологи-

алиноза [11, 47].

Тромботическая микроангиопатия – вариант нефротоксичности CNI с преимущественным поражением эндотелия, ведущим к характерному поражению клубочков и артериол, сходному с таковым при гемолитико-уремическом синдроме. В острую фазу

117

ВЕСТНИК ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ	том XI № 3–2009

основным проявлением ТМА является образование фибриновых тромбов. Помимо этого в клубочках часто отмечаются явления ишемии, просвет капиллярных петель сужен из-за выраженного набухания эндотелиальных клеток. В других клубочках может, напротив, наблюдаться паретическое расширение капиллярных петель, содержащих эритроцитарные и фибриновые тромбы. Могут также наблюдаться явления мезангиолиза. Для артериол и мелких артерий характерно расширение субэндотелиального пространства, набухание эндотелиальных клеток, фрагменты эритроцитов в субэндотелиальной области, а также явления тромбоза и фибриноидного некроза стенок. Наиболее характерным для цикло- спорин-ассоциированнойТМА, какидлянефротоксичности CNI в целом, считается поражение приносящих артериол. В дальнейшем по мере репарации поврежденных эндотелиальных клеток и реканализации тромбов в клубочках отмечаются явления коллапса (утолщение и сморщивание капиллярных стенок), формируются двухконтурные базальные мембраны. Сосудистые изменения включают в себя миоинтимальную пролиферацию по типу «луковой шелухи», склероз интимы, артериологиалиноз. Наряду с этим прогрессируют и неспецифические признакиформирующегосянефросклероза: сегментарный и глобальный гломерулосклероз (преимущественно по ишемическому типу), фиброз интерстиция и атрофия канальцев.

ВИРУСНЫЕ ПОРАЖЕНИЯ ТРАНСПЛАНТАТА

Наиболее часто поражение трансплантата, ведущее к развитию нефросклероза, отмечается при полиомавирусной и цитомегаловирусной инфекции.

В основе развития полиомавирусной нефропатии лежит поражение вирусом эпителия канальцев и инициированная им клеточная воспалительная реакция, напоминающая картину интерстициального нефрита. Уже на ранних стадиях этого процесса можно обнаружить характерные вирусные включения. Чащевсегоонивыглядяткакгиперхромныебазофильные внутриядерные включения. Эти изменения, какправило, сочетаются сотекоминтерстиция, инфильтрацией его лимфоцитами и плазматическими клетками, а также явлениями тубулита. Повреждение канальцев проявляется некрозом отдельных тубулоцитов, слущиванием их в просвет канальцев и оголением тубулярной базальной мембраны. В дальнейшем, по мере прогрессирования процесса активная воспалительная реакция сменяется развитием нефросклероза [12].

При цитомегаловирусной инфекции поражение РАТ определяется в 25–30% всех случаев клинически манифестного заболевания (ЦМВ-болезни) [11]. При этом наиболее часто патологические измене-

ния затрагивают клетки эпителия канальцев либо эндотелиоциты. Для цитомегаловирусной инфекции характерно выявление как внутриядерных, так и цитоплазматических изменений. В пораженных клетках определяется кариомегалия с центральными внутриядерными включениями, окруженными ободком по типу «совиного глаза». Как правило, подобные изменения сочетаются с очаговой инфильтрацией интерстиция мононуклеарами, впоследствии сменяющейся формированием неспецифического фиброза интерстиция и атрофии канальцев.

ОБСТРУКТИВНАЯ НЕФРОПАТИЯ

Морфологическая картина при обструктивной нефропатии представляет собой интерстициальный фиброз в сочетании с атрофией канальцев. Канальцы дилатированы, просвет их заполнен белковыми цилиндрами, содержащими белок Тамма–Хорсфал- ла. Характерной особенностью являются разрывы тубулярной базальной мембраны с выходом белка Тамма–Хорсфалла в интерстиций. Поражения клубочковвторичныипроявляютсябольшимколичеством атубулярных клубочков с перигломерулярным фиброзом и утолщением капсулы Боумена.

ПИЕЛОНЕФРИТ ТРАНСПЛАНТАТА

Хронический пиелонефрит трансплантата характеризуется формированием крупноочагового склероза интерстиция и атрофии канальцев по типу «щитовидной почки». Инфильтрация интерстиция нейтрофилами и явления тубулита могут присутствовать в той или иной степени в зависимости от активности процесса. Изменения в клубочках развиваются вторично по отношению к изменениям в тубуло-интерстициальном пространстве и характеризуются утолщением капсулы Боумена, явлениями ишемии капиллярных петель и тотальным либо сегментарнымгломерулосклерозомразличнойстепени выраженности. Часто эти изменения развиваются у пациентов с обструктивной нефропатией, везикоуретральным рефлюксом или возвратом почечнокаменной болезни в трансплантате.

ВОЗВРАТНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Возвратная патология диагностируется при развитии в трансплантате морфологической картины, сходнойстаковойвсобственныхпочках. Существует широкий спектр патологий, как гломерулонефритов, так и метаболических заболеваний, способных рецидивировать в трансплантате, однако вероятность рецидива и его влияние на прогноз операции в значительной степени различаются [17, 42].

118