56.Электрофоретические методы разделения биоматериалов. Примеры применения в клинической практике. Значение электрофореза в протеомном анализе.

Электрофорез – метод разделения веществ, основанный на явлении миграции заряженных микрочастиц в жидкой среде под действием электрического поля. Электрофорез широко используется для полуколичественного определения белков сыворотки крови и для выявления парапротеинов. Электрофорез проводится с сывороткой, а не с плазмой, так как присутствие фибриногена в плазме приводит к образованию выраженной β2-полосы, что может быть расценено как парапротеинемия

Электрофоретические методы:

1. зональный (полуколичественный метод, позволяющий разделить смесь белков в зависимости от их молекулярной массы и электрического заряда). С помощью зонального электрофореза можно исследовать не только сыворотку, но и другие биологические жидкости, например спинномозговую жидкость и мочу. Этот метод позволяет оценить белковый состав исследуемой пробы и выявить моноклональные антитела.

2. изофокусирование

3. изотахофорез (метод разделения различных типов ионов по их подвижности в электрическом поле). Применение: аналитическое разделение (мкг) пептидов,белков,нуклеотидов,органических кислот,ионовметаллов(частичноизотопов) с высоким разрешением; препаративное разделениебелков(г), накопление в виде узкой зоны следовых количеств веществ (мкг) из больших объемов пробы вследствие эффекта концентрирования, определение электрофоретической подвижности.

Свободный (фронтальный) электрофорез:

В этом случае электрофорез проводят в приборах, существенной частью которых является U-образная трубка. Нижнюю часть трубки заполняют испытуемым объектом, например раствором белка, на который наслаивают растворитель. В растворитель погружают электроды, соединенные с источником постоянного тока. При этом электрически заряженные частицы белка перемещаются к одному из электродов, вследствие чего граница раздела между раствором и растворителем в одном колене поднимается (восходящая граница), а в другом опускается (нисходящая граница). Приборы для свободного электрофореза, снабженные устройством автоматической регистрации перемещения каждого компонента в исследуемом объекте, применяют при анализе дисперсных систем, выделении из них отдельных компонентов, а также при клиническом исследовании сыворотки крови.

Свободный (фронтальный) электрофорез получил широкое распространение для исследования нормальных и патологических сывороток, установления состава белковых смесей, определения чистоты белков.

Электрофорез на носителях (зональный электрофорез):

В качестве носителей используют бумагу, гели крахмала, агара, полиуретанов и др. В клинических лабораториях особо широкое распространение для исследования сыворотки крови получил электрофорез на бумаге, который проводится следующим образом: на полоску специального сорта бумаги, пропитанной соответствующим буферным раствором (см.), наносят капельку сыворотки крови. Концы полоски опускают в чашечки, заполненные данным буферным раствором и снабженные электродами. При пропускания постоянного электрического тока отдельные белки сыворотки перемещаются вдоль полоски с разными скоростями, а иногда и в разных направлениях. По истечении определенного времени пропускание тока прекращают, полоску бумаги подсушивают и обрабатывают реактивом на белок. При этом на бумажной электрофореграмме выявляются окрашенные пятна. По числу пятен судят о количестве белковых фракций, а по интенсивности окраски пятен — о количественном содержании каждой белковой фракции в исследуемой сыворотке.

В последнее время широкое применение в исследовательской работе и в клинической диагностике находит электрофорез в тонких слоях гелей, нанесенных на стеклянные пластинки (дисковый электрофорез), а также помещенных в стеклянные трубочки.

Особенно широкое распространение получил электрофорез на бумаге (бумажный электрофорез) при исследовании и разделении белков, нуклеиновых кислот, стеринов, аминокислот, жирных кислот и других биологически активных веществ.