3 КУРС / Микробиология лабораторный практикум

клетки – телиоспоры. Это ржавчинные (порядок Uredinales) и головневые (порядок Ustilaginales) грибы – исключительно паразиты высших растений.

Головневые грибы насчитывают до 1000 видов, часто паразитируют на злаках и могут поражать растение во все периоды его развития. Особенно сильно разрастается мицелий в тканях цветочных органов (метелки или колоса), при этом мицелий превращается в пылящую массу темных спор, которые могут сохраняться жизнеспособными в течение многих лет.

Ржавчинные грибы отличаются сложным циклом развития, разнообразием форм спороношения, чередующихся в определенной последовательности. Свое название ржавчинные грибы получили в связи с появлением ржавых пятен или полос на пораженных частях растения. Цвет пятен обусловлен наличием в мицелии и спорах капель масла, содержащего оранжевый пигмент. Поражение растений ржавчиной приводит к их недоразвитию, задержке образования колосков, гибели.

Применение методов анализа ДНК к систематике базидиомицетов привело к существенной коррекции их классификации, основанной на морфологических признаках. По данным геносистематики выделены также три подкласса, но с иными границами: Urediniomycetidae (ржавчинные),

Ustilagomycetidae (головневые) и Hymenomycetidae (гименомицеты). В

последнюю группу входят представители морфологических подклассов холобазидиомицетов и гетеробазидиомицетов.

Современный класс Agоnомусетеs. Включает грибы, не образующие спороношений (Mycelia sterilia). В цикле их развития имеются только мицелий и склероции.

12.3.4 Характеристика митоспоровых грибов

Группа анаморфные (митоспоровые грибы). Старое название – класс Deuteromycetes (несовершенные грибы). Одна из крупнейших групп грибов (более 20 тыс. видов), представители которой неоднородны с филогенетической точки зрения, но является группой параллельно эволюционирующих организмов с точки зрения эколого-морфологической. Мицелий хорошо развитый, многоклеточный, сходный по строению с мицелием сумчатых грибов. Половой процесс отсутствует, однако у дейтеромицетов, так же как у базидиомицетов или аскомицетов, доказано наличие парасексуального процесса. В результате объединения протопластов, содержащих ядра разного типа, возникают гетерокарионы. Введенное в мицелий чужое ядро размножается, и образовавшиеся дочерние ядра распространяются по мицелию. Время от времени происходят кариогамия и мейоз. Таким образом, парасексуальный цикл обеспечивает рекомбинацию ядерного материала, как и истинный половой процесс.

Конидиальная стадия у этих грибов очень сходна с той, которая характерна для хорошо изученных аскомицетов.

91

Конидии образуются на гаплоидном мицелии, на многоклеточных или реже одноклеточных конидиеносцах, представляющих ветви мицелия, обычно поднимающиеся над ним. Они могут быть малодифференцированными, не отличающимися от вегетативных гиф мицелия, но чаще хорошо развиты. Увеличение продукции конидий достигается путем ветвления конидиеносцев различным образом (мутовчатое, моноподиальное, симподиальное, дихотомическое и др.), путем образования расширений конидиеноцев или же образованием конидий в длинных цепочках.

Конидии могут быть одноклеточными и многоклеточными, распространяются обычно воздушными течениями. В воздухе их можно обнаружить в больших количествах. У некоторых видов вместо конидий образуются оидии или почкующиеся округлые клетки, напоминающие дрожжи.

В XIX в. известный итальянский миколог П. Саккардо (1880) создал систему несовершенных грибов, основанную на морфологии конидий и конидиогенных структур. Он выделил несколько порядков:

Moniliales (гифомицеты) – конидиеносцы располагаются непосредственно на мицелии, открыто, одиночно или в пучках – коремиях (современный класс Нурhoтусеtеs);

Melanconiales (меланкониевые) – конидиеносцы располагаются в ложе; Sphaeropsidales (пикнидиальные) – конидиеносцы в пикнидах. Последние два порядка впоследствии объединили в группу целомицетов

(Coelomycetales) (современный класс Coelomycetes).

Классификация несовершенных грибов внутри порядков была основана на параллельной изменчивости, иллюстрирующей гомологические ряды Н.И. Вавилова: виды с темноокрашенными и светлыми конидиеносцами и конидиями, в свою очередь, разделяют на виды с одноклеточными и многоклеточными конидиями и т.д.

Система Саккардо удобна для практического определения грибов. Однако она основана исключительно на морфологии, поэтому один тот же сумчатый гриб может иметь несколько типов конидиального спороношения. С другой стороны, один и тот же тип конидиального спороношения может вырабатываться у сумчатых грибов, также относящихся к разным порядкам. Следовательно, после потери половой стадии эти неродственные грибы объединяют в один род.

Классификация несовершенных грибов основана на формах спороношения и других внешних признаках и служит только практическим целям (для номенклатуры и определения). В последних системах грибов класс Deuteromycetes упразднен как искусственный, и дейтеромицеты под названием митоспоровые грибы (их ядра претерпевают только митотические деления) распределены по порядкам и семействам сумчатых. Грибы, имеющие спороношения, подобные анаморфам определенных таксонов сумчатых,

92

помещают в эти таксоны; для иных видов несовершенных грибов единственный путь соотнесения с сумчатыми – степень сходства ДНК.

Несовершенные грибы широко распространены в природе, многие вызывают плесневение и порчу сельскохозяйственного сырья, различных пищевых продуктов и органических материалов.

К несовершенным грибам относятся анаморфы грибов Aspergillus (леечная плесень) и Penicillium (кистевидная плесень), объединяющие более 200 видов и отличающиеся друг от друга конидиальной стадией. Размножение осуществляется в основном бесполыми спорами – конидиями. При половом процессе сумки образуются в шаровидных плодовых телах – клейстотециях.

Грибы из рода аспергилл – одни из наиболее распространенных гифомицетов. Естественное местообитание их – верхние горизонты почвы, особенно в южных широтах. Но чаще всего их обнаруживают на различных продуктах, главным образом растительного происхождения, где колонии их образуют плесневые налеты разного цвета. Большинство видов аспергиллов – сапротрофы, но в этом роде имеются и токсинообразователи, и паразиты животных и человека.

Вегетативное тело аспергиллов – многоклеточный, очень ветвистый мицелий, пронизывающий субстрат. Клетки мицелия многоядерные. Иногда развивается и обильный воздушный мицелий. У большинства аспергиллов плесневой налет состоит из конидиеносцев с конидиями (рис. 26). Конидиеносцы отходят вверх от особых клеток мицелия – опорных клеток. Верхняя часть конидиеносца вздувается, образуя пузырь.

Рисунок 26 – Гриб Aspergilus: а – колония на агаровой среде, б – общий вид конидиеносцев ( 10), в – микрофотография мицелия и конидиеносца ( 40)

На пузыре или радиально, или только в верхней его части размещаются клетки – фиалиды, из узкого горлышка которых выходят одна за другой, располагаясь в цепочку, одноклеточные конидии. Чем выше по цепочке, тем

93

конидии крупнее, массивнее окрашены и более зрелые.

Некоторые группы и виды аспергиллов широко распространены в природе и имеют весьма существенное практическое значение. Это в первую очередь представители группы A. niger, у которых коричневые, шоколадные или черные конидии. Они отличаются многообразной биохимический активностью: вырабатывают ферменты (амилазы, протеиназы, хитиназы и др.), способны синтезировать витамины (биотин, тиамин, рибофлавин), органические кислоты (лимонную, щавелевую, глюконовую).

Не меньшее значение имеют грибы группы A. flavus-oryzae. Для них характерна желтовато-зеленая окраска колоний. Эти грибы встречаются в почве и на самых разнообразных субстратах: растительных остатках, фураже, пищевых продуктах, растительных маслах, пластмассах и других материалах. Разнообразие заселяемых субстратов объясняется тем, что у видов этой группы особенно богатый набор ферментов. Спиртовая промышленность Японии и других стран Востока целиком основана на ферментативных свойствах грибов этой группы. Ферменты A. oryzae («така-койи») гидролизируют крахмал рисовых зерен при изготовлении рисовой водки – сакэ.

Грибы рода Penicillium занимают первое место по распространению среди гифомицетов. Естественный резервуар их – почва, приурочены больше к почвам северных широт. Наиболее часто обнаруживаются в виде плесневых налетов, состоящих из конидиеносцев с конидиями на разных субстратах, в основном растительного происхождения.

Грибы рода Penicillium имеют многоклеточные ветвящиеся конидиеносцы. На концах разветвлений конидиеносца располагаются фиалиды с цепочками конидий. Общий вид конидиеносца напоминает кисточку, метелку, отсюда русское название гриба – кистевик. Колонии грибов этого рода на питательной среде плотные, чаще бархатистые, иногда пушистые. Окраска разнообразная, но большинство имеют голубоватозеленый, зеленый и серо-зеленый оттенки (рис. 27). Многие виды издают острые запахи, в частности плесенный, затхлый.

Внимание к пенициллам возросло, когда у них впервые была открыта способность к образованию антибиотика пенициллина. В 1928 г. в Великобритании профессор А. Флеминг выделил гриб в чистую культуру и назвал P. notatum. В 1941 г. Х. Флори, Э. Чейн и другие ученые описали методы получения, очистки пенициллина и результаты клинических испытаний. В 1943 г. в России активные штаммы P. chrysogenum были выделены З. В. Ермольевой. С работ по повышению продуктивности пенициллов началась история научной селекции микроорганизмов.

Из лесных почв и подстилки выделяется P. thomii. Очень большое значение имеют пенициллы из серии P. roqueforti и P. camamberti. Они обитают в почве, но преобладают в группе сыров, характеризующихся

94

«мраморностью» – Рокфор, Камамбер, Бри. Масса сыра под воздействием ферментов грибов приобретает сочность, маслянистость, специфический вкус и аромат. Есть и вредоносные виды: P. italicum и P. digitatum вызывают гниение плодов цитрусовых.

Рисунок 27 – Гриб Penicillium: а-в – колонии пенициллов на агаровой среде, г-е – конидиеносцы с конидиями при разном увеличении ( 10, 40, 100)

Некоторые несовершенные грибы являются возбудителями болезней культурных и лесных растений.

Род Fusarium представляет обширную биологически неоднородную группу грибов. Среди них есть сапротрофы и паразиты растений. Конидиальное спороношение у фузариев чрезвычайно разнообразно по морфологии. Грибы образуют два типа конидий: микро- и макроконидии. Макроконидии – веретеновидные, серповидные, с 3-5 перегородками. Микроконидии чаще одноклеточные (рис. 28а). Разные виды имеют характерную окраску мицелия на питательной среде от белого, бледнорозового, желтоватого до темно-красного, сиреневого или бурого цветов, окрашивая при этом среду. Иногда колонии совершенно белые или с оранжевыми оттенками.

Большую опасность представляют возбудители корневых гнилей и сосудистых микозов сельскохозяйственных и лесных культур. Некоторые виды фузариев образуют токсические для человека и животных вещества и вызывают заболевания при употреблении в пищу продуктов из пораженного зерна: «пьяный хлеб» (возбудитель F. graminearum) и алиментарнотоксическую алейкию (возбудитель F. sporotrichioides).

95

Рисунок 28 – Колонии и бесполое спороношение некоторых анаморфных фитопатогенных грибов: а – Fusarium, б – Alternaria, в – Cladosporium, г – Verticillium

Род Alternaria образует многоклеточные темные конидии округлой или грушевидной формы, сидячие цепочками или одиночно на слаборазвитых

96

конидиеносцах. Колонии бархатистые, сначала оливково-коричневые, позже черного цвета (рис. 28б). Широко распространены в почве, встречаются в свежеубранном зерне различных культур (черный зародыш), вызывая болезни сеянцев и саженцев хвойных растений в лесопитомниках, гниль корнеплодов, а также порчу некоторых молочных и мясных продуктов.

Род Cladosporium – имеет слабо ветвящиеся конидиеносцы, несущие на концах овальные споры в виде гроздей. Мицелий и конидии окрашены в темно-оливковый цвет (рис. 28в). Выделяет в окружающую среду темный пигмент. Встречается в почве, на зерне, а также вызывает порчу продуктов животного происхождения – сыра, масла, колбасы, мяса, яиц. Может развиваться при малом доступе кислорода.

Род Verticillium – возбудитель увядания или вертициллеза – вызывает корневые гнили, черную пятнистость различных растений (рис. 28г).

Род Botrytis имеет древовидно ветвящиеся конидиеносцы, несушие на концах ветвей большое число одноклеточных конидий. Мицелий и колонии серого или коричневато-оливкового цвета. Вызывает порчу плодов, ягод и овощей, явялется возбудителем болезней сеянцев лесных культур.

Род Oidium – образует разветвленный белый мицелий, гифы которого легко распадаются на оидии. Один из видов этого рода – O. lactis – молочная плесень, часто развивается в виде бархатистой пленки на поверхности квашенных овощей и кисломолочных продуктов при их хранении. Гриб разлагает молочную кислоту, а также жир и белки этих продуктов, подвергая их быстрой порче.

Грибы рода Trichoderma распространены повсеместно в разнообразных географических регионах. Для них характерны очень быстрорастущие колонии, обильное зеленое (иногда белое) спороношение. Конидиеносцы от слабо дифференцированных, образующихся в воздушном мицелиии, до сложных древовидно разветвленных, образующихся в подушечках (рис. 29).

Рисунок 29 – Колонии и конидиальное спороношение гриба Trichoderma

97

Грибы рода Trichoderma хорошо известны как продуценты антибиотиков и высокоактивных экзоферментов (целлюлаз, гемицеллюлаз, хитиназ и др.). Они могут использовать практически любой растительный субстрат, в том числе отходы лесоперерабатывающей промышленности и сельского хозяйства, с высоким выходом биомассы гриба-продуцента. Такие технологии позволяют утилизировать отходы и получать при этом ценные биологически-активные вещества и биоудобрения. Грибы рода Trichoderma также широко применяются в производстве препаратов для биологической защиты растений от грибных и бактериальных болезней – корневых гнилей, фузариоза, альтернариоза, фитофтороза и др.

Задание: ознакомиться с характерными особенностями строения мицелия и органов спороношения грибов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus, Fusarium.

План выполнения работы

1.Ознакомиться с органами спороношения грибов Aspergillus, Penicillium, Rhizopus на демонстрационных препаратах.

2.Промикроскопировать колонии грибов рода Mucor непосредственно в

чашках Петри при малом увеличении (объектив 4, 10). Зарисовать общий вид.

3. Приготовить прижизненные препараты грибов Fusarium раздавленная капля, подкрасить метиленовым синим. Просмотрев приготовленные препараты с объективом 8 (общую картину строения) и заметив участок, наиболее четко отражающий характер спороношания данного гриба, поставить объектив 100 и при этом увеличении зарисовать гифы и споры.

Вопросы для самостоятельного контроля

1.Как рассматривается современное систематическое положение грибов

вмире живых существ?

2.Какие основные таксономические критерии используются для классификации грибов?

3.Что означают термины «гетерокариоз», «анаморфа», «телеоморфа»?

4.Какие экологические группы выделяют среди грибов?

5. В чем особенность систематики митоспоровых грибов?

6. Какие способы размножения известны у грибов?

7. Какие зоо- и фитопатогенные грибы имеют важное значение? 8. Какие типы питания встречаются у грибов?

9. Какими признаками характеризуются роды Penicillium и Aspergillus?

98

ЗАНЯТИЕ 13. Характеристика эукариотных микроорганизмов. Дрожжевые грибы

13.1 Мицелиально-дрожжевой диморфизм

Грибам присуще явление, получившее название диморфизма: есть грибы, у которых отмечается дрожжеподобный рост (одиночные или в коротких цепочках округлые клетки, не имеющие полярности и размножающиеся почкованием), и грибы с мицелиальным ростом (цилиндрические клетки в разветвленных нитях с отчетливой полярностью – ростом верхушкой, размножающиеся делением). Многие виды грибов в разных условиях могут находиться в мицелиальном или дрожжевом состоянии. Таким образом, под дрожжами понимают все высшие грибные организмы, находящиеся в одноклеточной форме в ростовой фазе и размножающиеся почкованием или делением.

Мицелиально-дрожжевой диморфизм обусловлен различными причинами:

1.Физиологией питания. Мицелиальные формы несовершенных грибов из рода Verticillium живут, как сапротрофы в почве, но могут заражать корни высших растений, проникать в сосуды ксилемы и существовать там в дрожжеподобной форме, вызывая увядание (вилт) пораженного растения. Другой гриб Candida albicans в дрожжевой форме паразитирует в позвоночных животных и человеке, вызывая поражения внутренних органов (глубокие микозы), а в мицелиальной форме живет в почве и питается растительными остатками.

2.Состоянием ядер в клетке. Базидиальные грибы из порядка Ustilaginales и сумчатые из порядка Taphrinaies образуют в зараженных тканях высших растений хорошо развитый мицелий, клетки которого содержат по два ядра (дикарионы). Такой мицелий не может расти на искусственных питательных средах, он – облигатный (обязательный) паразит. Но одноядерные споры этих грибов (аскоспоры тафриновых и базидиоспоры головневых) размножаются почкованием, образуют дрожжеподобные колонии на искусственной среде и не способны заражать растения.

3.Газовым составом среды. Некоторые зигомицеты из рода Mucor в аэробных условиях существуют в мицелиальной форме, а в анаэробных – в дрожжевой.

Мицелиально-дрожжевой диморфизм обусловлен кардинальной перестройкой морфологии, физиологии и метаболизма грибов. При переходе

кдрожжеподобному росту изменяются физиология важнейших энергетических процессов (дыхание заменяется на брожение); образ жизни (паразитический или сапротрофный); химический состав клеточной стенки

99

(глюканы заменяются на маннаны) и цитоплазматической мембраны (содержание входящих в нее углеводов падает, а белка и липидов – увеличивается).

13.2 Морфология и физиология дрожжевых грибов

Важным следствием одноклеточного существования является повышение метаболической активности, интенсификация обмена с окружающей средой в результате увеличения отношения поверхности клетки к ее объему.

По форме дрожжевые клетки разнообразны: круглые, овальные

(Trichosporon), яйцевидные (Candida), стреловидные (Brettanomyces),

цилиндрические (Endomyces), лимоновидные (Nadsonia), грушевидные (Schizoblastoporium), треугольные (Trigonopsis), многоугольные, серповидные (Selenotila). В некоторых случаях форма клетки бывает настолько характерна, что она может служить опознавательным признаком рода. Строение клетки дрожжей типично для эукариотов. Размеры клеток варьируют от 1,5-2, Pichia до 10 мкм (Saccharomycodes) по ширине и достигают 20 мкм и более в длину.

Некоторые дрожжи образуют капсулы (Cryptococcus), включения гликогена (Cryptococcus), волютина (Saccharomyces), жира в виде отдельных капель (Trichosporon) либо одной липидной вакуоли (Lipomyces). Клетки дрожжей богаты питательными веществами – белками, жиром, витаминами, – могут быть использованы для кормовых целей.

Размножение дрожжей осуществляется различными способами. Наиболее типичным способом бесполого размножения является почкование; бинарное деление наблюдается редко. Клетки, получающиеся в результате почкования, могут оставаться соединенными, образуя псевдомицелий. Причем клетки мицелия могут быть одинаковыми либо разных размеров. В таком случае различают простой или дифференцированный ложный мицелий.

Удрожжей почки возникают одновременно (множественное почкование) или же всегда на одном и т ом же месте (по полюсам). Иногда при отделении почки от материнской клетки в перешейке закладывается перегородка – септа. Такой способ называется почкующимся делением.

Дрожжи, имеющие процесс деления, образуют истинный мицелий, в клетках которого могут образовываться эндоспоры.

Кроме почкования и деления многие дрожжи способны размножаться и

спомощью бесполых спор. Споры обычно образуются при неблагоприятных условиях и в присутствии большого количества кислорода.

Удрожжей Tilletiopsia и Bullera могут образовываться «отстреливающиеся» споры на стеригмах. Кроме того, дрожжевые гриба могуг образовывать артроспоры и хламидоспоры.

Жизненные циклы дрожжей включают чередование гаплоидных и

100