3 КУРС / Микробиология лабораторный практикум

Рисунок 19 – Типы споробразования: а – бациллярный, б – клостридиальный, в – плектридиальный

9.2 Характеристика рода Bacillus

Систематическое положение:

●Отдел Firmicutes

○Класс Bacilli

Порядок Bacillales

Семейство Bacillaceae

–Род Bacillus

Род Bacillus – типичный представитель семейства, один из наиболее крупных родов, включающий более 100 видов бактерий. Бациллы – прямые или слегка изогнутые палочки 0,5-2,5 1-5 мкм, с закругленными или обрубленными концами, часто в парах или цепочках (рис. 20). Подвижные за счет перитрихальных жгутиков или неподвижные. Эндоспоры овальные, иногда сферические или цилиндрические. Аэробы или факультативные анаэробы. Хемоорганотрофы с дыхательным и бродильным типом метаболизма. Хорошо растут на простых средах с добавлением растительного или дрожжевого экстракта, на пептонных средах. Они активно продуцируют различные гидролитические ферменты и поэтому способны использовать в качестве субстрата широкий круг органических соединений: белки, углеводы, жиры, гликозиды, спирты, органические кислоты. Могут сбраживать углеводы. Некоторые виды способны к фиксации азота.

61

Рисунок 20 – Вегетативные клетки и споры бактерий рода Bacillus, прижизненный препарат, окраска метиленовым синим ( 1000)

Основная масса бактерий рода Bacillus является мезофилами с оптимумом 30-45 С, но отдельные виды термофильные, растут при температуре до 65 С. Обнаруживаются в разных местообитаниях, некоторые виды патогенны для позвоночных или беспозвоночных.

Бактерии рода Bacillus имеют большое практическое значение как продуценты биологически активных веществ – ферментов, аминокислот, органических кислот, витаминов, антибиотиков (субтилина и бацитрацина). Их применяют в составе биопрепаратов для ликвидации нефтяных загрязнений в водоемах и почвах, используют как агентов защиты растений от болезней и вредителей.

Ряд бактерий вызывают порчу продуктов, в том числе консервированных (В. subtilis), молочных и кулинарных изделий (B. cereus). Спороносным бактериям, особенно их термофильным формам, отводится значительная роль в процессах самосогревания зерна. Некоторые виды обладают фитопатогенными свойствами.

Трансгенные штаммы В. subtilis используют для получения интерферонов, гормонов, пищеварительных ферментов и других препаратов медицинского назначения.

В. subtilis – сенная палочка, типичный представитель рода; обнаруживается повсюду в осевшей пыли, в почве, воде, воздухе, на поверхности растений, на пищевых продуктах и т.д. На питательных средах образует длинные цепочки, расположенные рядами. На жидких средах растет в виде пленки. Активно расщепляет органические азотистые соединения, углеводы. Глюкозу использует только в аэробных условиях с образованием больших количеств 2,3-бутандиола. Хорошо растет на ломтиках картофеля в виде бородавчатой или пузырчатой пленки желтого или розового цвета. Споры выдерживают кипячение до 30 минут, что используется при выделении культуры.

62

В. megaterium – широко распространены в почвах, среди истинных бактерий наиболее крупные по размерам палочки (до 5 мкм).

В. cereus – факультативно анаэробные, подвижные палочки в парах или длинных цепочках. Колонии обычно беловатые или кремового цвета, но некоторые штаммы образуют розовато-коричневый, желтый или желтоватозеленый флуоресцентный пигмент. Вызывает пищевые токсикоинфекции у человека (включая рвотный и диарейный синдром), продуцирует энтеротоксины.

К группе В. cereus причисляют также вид, получивший название B. mycoides за грибовидный рост на поверхности агара. Существуют право- и левозакрученные штаммы, но общий вид колоний очень типичен (рис. 21).

Рисунок 21 – Колонии различных представителей рода Bacillus на агаризованной питательной среде

63

В близком родстве с В. cereus находится В. anthracis – возбудитель сибирской язвы, отнесенный ко II группе патогенности; выделен в чистую культуру Р. Кохом в 1877 году. Сибиреязвенная палочка не имеет жгутиков и окружена капсулой из глутаминовой кислоты, обладающей антифагоцитарной активностью и адгезивными свойствами.

В. thuringiensis – патогенная для насекомых бактерия. Для В. thuringiensis характерно образование продуктов, проявляющих энтомоцидную активность. Это три вида экзотоксинов и эндотоксин. В соответствии с правилом называть токсины по порядку их открытия фосфолипаза С (лецитиназа С) была названа -экзотоксином. Этот фермент вызывает распад незаменимых фосфолипидов в тканях насекомых, приводя их к гибели.

Второй токсин – -экзотоксин, или термостабильный экзотоксин, получил свое название за сравнительно хорошую стабильность при высокой температуре: активность сохраняется при автоклавировании в течение 15 минут при 121°С. В состав токсина входят аденин, рибоза и фосфор в соотношении 1:1:1. Действие -экзотоксина обусловлено ингибированием синтеза РНК.

Третий токсин – -экзотоксин, относится к фосфолипидам.

Четвертый токсин -эндотоксин, или параспоральный кристаллический эндотоксин, образуется одновременно со спорой в противоположной части бактерии. Вначале он выглядит бесформенным комочком, постепенно превращаясь в правильный восьмигранник. У большинства разновидностей В. thuringiensis образование споры и кристалла сопровождается распадом стенки клетки, в результате споры и кристаллы освобождаются и поступают в культуральную среду. Кристаллы по своему химическому строению представляют собой белковое соединение. Это самый активный энтомоцидный токсин. Ядовитые свойства кристаллов сказываются только в том случае, если они попадают в пищеварительный тракт насекомого.

Ферменты насекомого превращают протоксин кристалла в непосредственно действующий настоящий токсин. Разница в восприимчивости различных видов насекомых к действию кристалла связана со специфичностью кишечных протеаз, контролирующих гидролиз кристаллов in vivo. Этими протеазами обладают не все насекомые, с чем и связана избирательность действия токсина. В ЖКТ человека рН низкая, поэтому они не растворяются и не являются токсичными.

Штаммы B. thuringiensis вызывают гибель насекомых вредителей леса (в частности, сибирского шелкопряда), многих вредителей сада и сельскохозяйственных культур (капустной белянки, хлопковой совки и т. д.), а также некоторых видов мух. Механизм действия на организм насекомого может иметь различный характер: при развитии в организме патогенной бациллы возникает заболевание септицемия, а последействие кристалла

64

вызывает токсикоз.

В настоящее время различные варианты культуры B. thuringiensis широко используются для изготовления энтомоцидных препаратов (энтобактерин, инсектин, лепидоцид, битоксибациллин и др.). Их применение позволяет в короткие сроки уничтожить вредителей на значительных площадях без ущерба для окружающей среды.

9.3 Использование терморезистентности спор для получения накопительной культуры бактерий рода Bacillus

В колбу поместить 10 г измельченного сена, залить водой (100 г), закрыть пробкой и кипятить в течение 10 минут. Затем культивировать в термостате при 20-30 C в течение 2-3 дней. На поверхности суспензии вырастает серо-белая пленка, почти полностью состоящая из палочек

B. subtilis.

Для получения накопительной культуры картофельной палочки истертый в кашицу картофель поместить в пробирку или колбу, прогреть на водяной бане при 100 C в течение 30 минут и оставить при комнатной температуре. На картофеле образуется плотная морщинистая пленка, состоящая из бактерий.

Задание: ознакомиться с особенностями морфологии бактерий рода Bacillus и методами окраски спор

План выполнения работы

1.Приготовить и просмотреть прижизненный препарат бактерий рода Bacillus с окраской метиленовым синим. При исследовании живых препаратов, изготовленных из старых, главным образом агаровых, культур, споры чаще всего обнаруживаются в виде овальных или круглых образований, резко преломляющих свет. Зрелые споры обычными растворами красок не окрашиваются. При расположении внутри клеток они видны на фоне окрашенной цитоплазмы. У спор, вышедших из клетки, окрашена только оболочка.

2.Окрасить споры по методу Ожешко или по методу Пешкова. Споры имеют очень плотную оболочку, состоящую из наружного и внутреннего слоев. Все специальные методы окраски спор основаны на действии различных протрав, изменяющих структуру оболочки и тем облегчающих проникновение в споры красящего вещества. После протравливания препараты окрашивают обычно карболовыми растворами красок с подогреванием мазка, последующим обесцвечиванием и дополнительной окраской. Эндоспоры очень устойчивы к простому окрашиванию, но, будучи однажды окрашенными, они довольно устойчивы и к обесцвечиванию.

65

Способ Пешкова – наиболее простой и демонстративный; он не требует химических протравителей и дифференцировки.

1.Приготовить тонкий мазок.

2.Зафиксировать на пламени горелки.

3.Окрасить кипящей леффлеровской метиленовой синькой (над пламенем спиртовки) в течение 15-20 секунд.

4.Промыть водой.

5.Докрасить 0,5 %-м водным раствором нейтрального красного в течение 30 секунд.

6.Промыть водой и высушить.

Микроскопическая картина: споры голубого или синего цвета, молодые споры черно-синие, цитоплазма вегетативных форм розовая.

Способ Ожешко

1.Приготовить тонкий мазок, высушить на воздухе. Не фиксировать!

2.Обработать мазок 0,5 %-м раствором соляной кислоты, которую наливают в избытке и подогревают в течение 2 минут на спиртовке. Стекло держат высоко над пламенем до появления паров.

3.Остудить стекло и слить кислоту. Промыть препарат водой.

4.Окрасить мазок карболовым фуксином Циля, подогревая на небольшом пламени до появления паров, в течение 5 минут. Затем остудить и промыть водой.

5.Обработать мазок 1 %-м раствором серной кислоты в течение 2 минут. Быстро промыть водой. После такой процедуры клетки бактерий обесцвечиваются.

6.Провести дополнительную окраску спиртовым раствором метиленового синего в течение 5 минут, после чего обильно промыть водой и просушить.

Микроскопическая картина: споры окрашиваются в красно-розовый цвет, а вегетативные клетки бактерий – в сине-голубой.

7.Сделать зарисовки.

Вопросы для самостоятельного контроля

1.Какими признаками характеризуется семейство Bacillaceae? В чем отличительная особенность его представителей?

2.Какие типы спорообразования обнаружены у бактерий родов Bacillus

иClostridium?

3.Сколько спор формируется внутри материнской клетки? Чем споры отличаются от вегетативных клеток бактерий?

4.Какими признаками характеризуется типичный представитель рода Bacillus – сенная палочка?

5.Какие биологически активные вещества синтезируют бактерии рода

Bacillus?

66

6.В чем заключается практическое значение бактерий рода Bacillus? Какова их экологическая роль в природе?

7.Какие представители рода Bacillus являются патогенными для человека?

8.Как действуют энтомопатогенные бациллы на насекомых?

9.Как можно получить накопительную культуру спорообразующих бактерий?

10.Как проводится окраска спор бактерий?

67

ЗАНЯТИЕ 10. Бактерии, осуществляющие маслянокислое брожение. Характеристика рода Clostridium. Окраска гранулезы

10.1 Маслянокислое брожение

Масляная кислота (бутират), н-бутанол, ацетон, 2-пропанол и ряд других органических кислот и спиртов являются типичными продуктами сбраживания углеводов анаэробными спорообразующими бактериями рода Clostridium. Продукты брожения образуются в разных соотношениях, кроме того, в большом количестве образуются газы: H2 и CO2.

Превращение глюкозы до пирувата осуществляется по гликолитическому пути. Следующая реакция (ключевая) – разложение пирувата до ацетил-КоА и CO2.

Путь, ведущий к синтезу масляной кислоты, начинается с реакции конденсации двух молекул ацетил-КоА. Он не связан с получением клеткой энергии (восстановительный), функция – акцептирование водорода, образовавшегося в процессе гликолиза. В связи с этим особое значение приобретает превращение ацетил-КоА, ведущее к синтезу ацетата, поскольку именно с этим путем связано дополнительное получение энергии в процессе маслянокислого брожения (при этом синтезируется молекула АТФ).

Основным источником выделяемых при брожении газообразных продуктов (CO2 и H2) служит реакция окислительного декарбоксилирования пирувата. У клостридиев описаны и другие пути образования молекулярного водорода.

Выведение уравнения маслянокислого брожения и определение его энергетического выхода затруднительно из-за лабильности процесса, состоящего из двух основных ответвлений: одного – окислительного, ведущего к образованию ацетата и АТФ, другого – восстановительного. Количественное соотношение между обоими ответвлениями зависит от многих внешних факторов (состав среды, стадия роста и др.). В целом на 1 моль сбраживаемой глюкозы в маслянокислом брожении образуется 3,3 моля АТФ. Это наиболее высокий энергетический выход брожения.

Некоторые клостридии (C. acetobutylicum, C. bejerinckii, C. cellobioparum

и др.) при сбраживании сахаров наряду с кислотами накапливают в среде нейтральные продукты (бутиловый, изопропиловый, этиловый спирты, ацетон). Это дало основание выделить как вариант маслянокислого брожения ацетонобутиловое брожение.

У клостридиев, осуществляющих ацетонобутиловое брожение, образование масляной кислоты происходит на первом этапе брожения. По мере подкисления среды (pH ниже 5) и повышения в ней концентрации

68

жирных кислот индуцируется синтез ферментов, приводящих к накоплению нейтральных продуктов (н-бутанола и ацетона). Накопление продуктов нейтрального характера приводит к снижению кислотности среды.

10.2 Маслянокислые бактерии

Систематическое положение:

●Отдел Firmicutes

○Класс "Clostridia"

Порядок Clostridiales

Семейство Clostridiaceae

– Род Clostridium

Род Clostridium – это один из самых крупных родов среди бактерий. Принадлежность к роду определяется на основании трех признаков: 1) способности образовывать эндоспоры; 2) облигатно анаэробного характера энергетического метаболизма; 3) неспособности осуществлять диссимиляционное восстановление сульфата.

Вегетативные клетки бактерий из рода Clostridium имеют форму прямых или слегка изогнутых палочек (0,3-2,0 1,5-20 мкм) с закругленными концами (рис. 22). Большинство видов грамположительные, подвижные. Движение осуществляется с помощью перитрихиально расположенных жгутиков. По мере старения в процессе развития клетки теряют подвижность, накапливают гранулезу (запасное вещество типа крахмала) и переходят к спорообразованию. Образующиеся споры овальной или сферической формы. Диаметр их, как правило, превышает диаметр вегетативной клетки, поэтому, если формирующаяся спора расположена в центре клетки, последние меняют форму, становясь веретеновидными; если же споры образуются у одного из клеточных концов, клетки приобретают форму барабанных палочек.

Рисунок 22 – Вегетативные и спорулирующие клетки клостридий

69

Клостридии – облигатные анаэробы. Они лишены цитохромов и каталазы, в значительном количестве содержат флавиновые ферменты. Однако спектр их чувствительности к молекулярному кислороду достаточно широк, что связано с обнаружением в клетках большинства клостридиев супероксиддисмутазы и с другими приспособлениями на уровне клеточных популяций, помогающими нейтрализовать токсические эффекты O2 и его производных. Именно при работе с клостридиями Л. Пастер в 1861 г. открыл форму жизни без кислорода.

Описано более 160 видов бактерий рода Clostridium. Классифицируют их по-разному. В зависимости от вида сбраживаемого субстрата выделяют несколько физиологических групп клостридиев:

1.Сахаролитические клостридии, использующие в качестве субстратов брожения вещества углеводной природы – моносахара, крахмал, клетчатка;

(C. butyricum, С. acetobutylicum, C. pasteurianum).

2.Протеолитические клостридии, субстратами брожения которых являются белки, пептиды, аминокислоты (С. histolyticum, С. sporogenes, С. tetani, С. botulinum).

3.Пуринолитические клостридии, специфически приспособленные к сбраживанию гетероциклических соединений – пуринов и пиримидинов (С. acidi-urici, C. cylindrosporum). Относящиеся к этой группе виды часто узкоспециализированы в отношении пищевых субстратов.

Таким образом, типы брожений, осуществляемых клостридиями, необычайно разнообразны в отношении как используемых субстратов, так и синтезируемых конечных продуктов, и виды, осуществляющие сбраживание углеводов по гликолитическому пути с накоплением масляной кислоты в качестве одного из основных продуктов, являются только одной из групп организмов, относимых к роду Clostridium.

Потребности клостридиев в питательных веществах отличаются большим разнообразием. Как правило, клостридии могут расти только на сложных, богатых органическими соединениями средах. Для них выявлена потребность в витаминах (главным образом группы В) и наборе аминокислот. Многие клостридии выделяют экзоферменты, расщепляющие макромолекулы (углеводы, белки) на составляющие их мономеры. Оптимальная температура

для роста составляет от 10 до 60 С.

Пути включения CO2 в клеточный метаболизм клостридиев различны. Углекислота может использоваться ими в качестве конечного акцептора электронов, что приводит к прямому восстановлению CO2 до формиата. Донорами электронов в этой реакции служат восстановленный ферредоксин или НАД-H2. Образовавшийся в результате восстановления CO2 формиат может подвергаться дальнейшему восстановлению и служить источником метильных групп, используемых для клеточных биосинтезов.

Для разных видов клостридиев показана активная фиксация CO2 на C2-

70