Разрешение и полезное увеличение в микроскопах

Качество изображения, полученного с помощью микроскопа, зависит от разрешения микроскопа. Разрешение микроскопа – величина, обратная минимальному расстоянию между двумя точками в образце, при котором эти точки видны отдельно. Когда это расстояние сравнимое с длиной волны света, происходит дифрация света, и изображение становится тусклым. Минимальное расстояние d, которое может быть решено микроскопом: d = λ/(2·n·sin θ) , где  λ - длина волны света в воздухе, n - показатель преломления среды между объективой линзы и изучаемым объектом и θ  - так называемый апертурный угол (рис. 7).   Апертурный угол – угол между двумя крайними лучами конического светового пучка, выходящего из точки рассматриваемого предмета и попадающего в объектив. Апертура объектива, равная A = n·sin θ/2 , обозначена на инструменте. Если две точки в образце разделены менее чем на d, их дифракционные картины накладываются друг на друга, в результате чего они не могут быть различены отдельно.

Рис. 7. Апертурный угол

Вычислено, что предел разрешения светового микроскопа составляет около 250 нанометров, что позволяет получить полезное увеличение (при котором глаз различаетвсе элементы структуры объекта, разрешимые микроскопом) равное 400. Эта величина является пределом полезного увеличения обычного светового микроскопа. Большее увеличение не будет способствовать рассмотрению никаких дополнительных деталей объекта.  

Есть два пути улучшить разрешение микроскопа: использовать наиболее короткие длины световых волн и заполнять пространство между рассматриваемым объектом и объективом жидкостью с большими показателями преломления. Так, погружение объекта в масло кедра, которое иеет показатель преломления n = 1,4, позволяет улучшить изображение объекта. Ультрафиолетовые лучи имеют меньшую длину волны, чем видимый свет, и позволяет увеличить разрешение микромкопа. Кроме того, ультрафиолетовые микроскопы используются для изучение струтутуры биологических макромолекул (например, нуклеиновых кислот и белков), которые сильно поглощают ультрафиолетовый свет, что позволяет получать хороший контраст.

Поляризационный и интерференционный микроскопы. Электронный микроскоп

В поляризиционных и интерференционных микроскопах используют волновые свойства света для улучшения контраста рассматриваемых прозрачных структур.   В поляризационных микроскопах объект, имеющий произвольную и нерегулярную структуру, освещают поляризованным светом. После прохождения через объект свет поступает в анализатор, установленный под углом 90⁰ к начальной плоскости поляризации. В таком положении в отсутствие объекта или если объект однородный поляризованый свет не проходит через анализатор.   Часто объект содержит структуры, показатели преломления которых зависят от направления светового луча и направления напряженности электрического поля. Например, A-диски в саркомерах поперечно-полосатых мышц. При попадании на них поляризованного света плоскость его поляризации поворачивается, и свет частично проходит через анализатор.   В интерференционном микроскопе освещающий объект свет разделяется на два луча. Один луч проходит через объект, имеющий структуры с различными показателями преломления. Второй луч не проходит через объект, направляясь в объектив. После прохождения первого луча через объект, возникает разность фаз между двумя лучами. При соединении лучей в окулярной части прибора между ними происходит интерференция, и формируется интерференционная картина, представляющая собой области различных интенсивностей света. Таким образом, многие структуры прозрачного объекта, обладающие различными показателями преломления, становятся видимыми.   Как было упомянуто выше, разрешение светового микроскопа ограничено величиной длины волны света. Значительно большее разрешение можно достигнуть заменой света на поток электронов. Хотя электроны являются частицами, они также обладают волновыми свойствами. В электронных микроскопах электроны, полученные термоэмиссией, направляются и ускоряются разностью электрических потенциалов и фокусируются магнитными линзами. Длина волны, полученная с помощью электронов, ускоренных разностью потенциалов 50кВ, в 5-10 меньше длин волн видимого света. На практике разрешение электронного микроскопа почти в 1000 раз превышает предельное разрешение светового микроскопа.