Дрожжи.
Цель занятия изучить культуральные и морфологические признаки дрожжей; освоить методы микроскопической оценки дрожжей; подсчета микробных клеток дрожжей в счетной камере Горяева.
Задания:
1) приготовить препараты «раздавленная капля» чистых культур различных физиологических рас дрожжей Saccharomyces cerevisiae и аспорогннных дрожжей;
2) изучить морфологию отдельных видов дрожжей;
3) определить содержание гликогена и метахроматина в дрожжевых клетках;
4) подсчитать количество нежизнеспособных дрожжевых клеток в исследуемой суспензии;
5) подсчитать количество дрожжевых клеток в исследуемой суспензии с помощью счетной камеры Горяева.
Препараты «раздавленная капля» просматривают с объективом 8Х и 40Х.
Оборудование и материалы: предметные и покровные стекла; камера Горяева, специальное отшлифованное покровное стекло, пипетки (микро пипетка и на 1 см3), раствор с массовой долей серной кислоты 5%, раствор метиленового синего по Леффлеру, раствор Люголя, кристаллизатор с водой, раствор фуксина или метиленового синего для простого окрашивания, метиленовый синий в разведении 1 : 40, бензин, набор красок, раствор йода, иммерсионное масло, бактериальные петли, пастеровские пипетки, микроскопы, бактериологические петли, препаровальные иглы, марлевые салфетки, суточные культуры дрожжей Candida, Torulopsis, Hausenula, Saccharomyces.
Теоретические сведения.
По современным представлениям в группу дрожжей объединяют одноклеточные микроскопические организмы, относящиеся к разным классам грибов, не образующие истинного мицелия, имеющие размеры в поперечнике 3-5 мкм, по длине – 10-15 мкм. Они встречаются среди различных классов высших грибов: аскомицетов, базидиомицетов и несовершенных грибов. Растут дрожжи на средах с кислым рН и образуют колонии мягкой консистенции, не врастающие в субстрат. Форма и цвет колоний различаются у разных видов дрожжей. Дрожжевые клетки могут иметь: округлую, овальную, яйцевидную, цилиндрическую, апикулятную или лимоновидную форму (рис. 33).
Структура клеток (рис. 34) более сложная, чем у бактерий, включает оболочку, цитоплазму, дифференцированное ядро и другие фрагменты. Оболочка дрожжей легко просматривается в обычном световом микроскопе. Содержимое клеток дрожжей на ранней стадии роста однородно, затем в центральной части появляются многочисленные вакуоли и гранулы. Форма вакуолей изменяется в зависимости от условий культивирования и возраста культуры: в молодых клетках дрожжей вакуоли обычно соответствуют форме клетки, в зрелых они несколько сдавлены, а в отмирающих клетках могут быть сморщены и сжаты в результате нарушения взаимодействия коллоидов внутри клетки.
В клетках дрожжей накапливается большое количество запасных питательных веществ: гликоген (вещество типа крахмала), капельки жира, а в вакуолях—волютин (метахроматин), основным компонентом которого являются полифосфаты.
Размножаются дрожжи вегетативным и половым путем. Вегетативные способы размножения почкование и деление; половой способ размножения связан с образованием спор. К почкующимся дрожжам относятся представители рода Saccharomyces (сахаромицеты), так называемые «культурные» дрожжи; к делящимся – виды рода Shizosaccharomyces (шизосахаромицеты). При почковании на поверхности клетки образуется один или несколько бугорков — почек, которые постепенно увеличиваются. Почки растут, пока не достигнут размеров материнской клетки, после чего происходит деление ядер. В почку из материнской клетки переходит часть протоплазмы и элементы ядра, после чего между двумя клетками образуется поперечная перегородка и почка отшнуровывается. Иногда почки, еще не отделившиеся, начинают почкование, образуя скопление дрожжевых клеток (рис. 35).
При половом процессе слияние вегетативных клеток ведет к образованию сумок со спорами или сначала могут сформироваться споры, которые в последующем копулируют друг с другом. Спорообразование может наступить после многократного размножения путем почкования. Обычно спорообразование наблюдается при истощении питательной среды и хорошей аэрации. Если такие дрожжи выращивать в постоянно обновляемой среде или с частыми пересевами, то клетки их все время могут сохраняться в вегетативном состоянии и размножаться только почкованием. Но достаточно перенести такие дрожжи в среду, бедную питательными субстратами, как большинство клеток переходит к спорообразованию. В одной клетке образуется 2 - 4, а иногда 8 - 12 спор. Клетка при этом рассматривается как аск (сумка), а споры — как аскоспоры.
К почкующимся дрожжам относятся представители рода Saccharomyces (сахаромицеты).
Споры дрожжей имеют толстые оболочки и довольно устойчивы к неблагоприятным воздействиям, но в меньшей степени, чем эндоспоры бактерий (быстро погибают при температуре 60 °С). Таким образом, образование спор у дрожжей — это одновременно процесс размножения и формирования устойчивых форм.
Некоторые виды дрожжей размножаются так же, как и бактерии, бинарным делением путем образования одной или нескольких поперечных перегородок. Такой способ размножения наблюдается, например, у представителей рода Schizosaccharomyces (шизосахаромицетов). Дрожжам размножение делением несвойственно, поэтому данный род является исключением, отклонением от нормы. Шизосахаромицеты размножаются и половым путем, образуя споры что характерно для сумчатых грибов. Размножение делением свойственно также дрожжам рода Endomyces.
Дрожжи способны разлагать различные сахара. Поэтому они встречаются там, где происходит выделение богатых сахаром соков: на фруктах, листьях, в нектаре цветов. В практической деятельности человека они издавна используются для получения хлеба, вина, пива, спирта, входят в состав кефирных грибков для производства кефира.
В настоящее время в промышленности применяют различные виды дрожжей: наибольшее значение имеют культурные расы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которые обозначают римскими цифрами (XII, XI и т.д.) или заглавной буквой, соответствующей первой букве названия расы: М – минская, Я – Якубовского и т.д. Определенные физиологические расы Saccharomyces cerevisiae используют в соответствии с их биологической активностью в различных отраслях пищевой промышленности.
Класс несовершенных грибов объединяет аспорогенные, (ложные) дрожжи, неспособные к половому размножению и образованию спор. К ним относятся представители рода Candida, Torulopsis, Cryptococcus, Rhodotorula, Pullularia и др. На твердых питательных средах такие организмы так же, как и сахаромицеты, образуют колонии различной консистенции. Несовершенные дрожжи имеют более характерную форму, отличающую их от других видов: стреловидную, треугольную, серповидную или колбовидную. Дрожжи родов Candida и Trichosporon наряду с круглыми и овальными клетками могут образовывать длинные клетки псевдомицелия. Они представляют собой довольно крупные одноклеточные организмы, в среднем 5 – 9 х 7 – 12 мкм, не образуют истинного мицелия, но могут вытягиваться в длину, соединяясь в цепочки. Такие образования называют псевдомицелием. Размножаются только почкованием, довольно широко распространены в природе. Они встречаются в различных водоемах, в почвах, на растениях, продуктах питания, в организме человека и животных. Некоторые виды Candida вызывают заболевание, называемое кандидозом, в биотехнологии используются для получения кормового белка при выращивании их на промышленных отходах (например, углеводородах), для получения некоторых аминокислот (Candida utilis для получения триптофана), витаминов (Candida guilliermondii для получения витамина В2 – рибофлавина).
Широко распространенными являются также дрожжи рода Torulopsis, различные их виды используются в производстве сбраживаемых напитков типа кумыса, но вызывают болезни пива и некоторых других продуктов, получаемых путем брожения. Эти болезни проявляются в потере аромата, появлении неприятного запаха или ослизнения.