2.Метод репортерных генов

Репортёрные гены (гены-репортёры, англ. reporter gene) в молекулярной биологии — гены, которые присоединяют к регуляторным последовательностям других генов для исследования проявлений генов в культурах клеток. Некоторые репортёрные гены используются исследователями, так как их экспрессия придаёт организму чётко выраженные легко измеряемые характеристики, некоторые, — так как они являются селективными маркерами. Репортёрные гены используют для того, чтобы определить уровень экспрессии гена в клетке или в популяции. Часто в генно-инженерные конструкции встраивают в качестве репортёра ген LacZ.

Интересующий исследователя ген и ген-репортёр обычно встраивают в одну генетическую конструкцию, а затем вводят её в клетку или организм. В случае клеток бактерий и эукариот для введения обычно используют кольцевые молекулы ДНК — плазмиды. Важно, чтобы ген-репортёр в норме не экспрессировался в клетке, тогда экспрессия гена-репортёра будет свидетельствовать о том, что интересующий ген попал в клетку.

Широкое применение находят репортёрные гены, кодирующие флюоресцентные и люминесцентные белки:

• ген медузы, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (англ. GFP), экспрессия которого проявляется в появлении зелёного свечения при освещении синим светом;

• ген фермента люциферазы, которая катализирует реакцию с люциферином и вызывает свечение;

• ген красного флуоресцентного белка dsRed;

• бактериальный ген LacZ, кодирующий фермент бета-галактозидазу, экспрессия которого приводит к появлению синей окраски на среде, содержащей субстрат X-gal;

• ген хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (англ. CAT) обуславливает устойчивость к антибиотику хлорамфениколу [2].

3.Инсуляторы

Инсулятор (insulator, от англ. insulate - изолировать, в переводе - изолятор): последовательность ДНК , предотвращающая некорректные взаимодействия между соседними доменами хроматина . Один тип инсуляторов определяет домены, блокируя взаимодействия промоторов из одного домена с энхансером из другого. Другой тип инсуляторов предотвращает распространение гетерохроматина. 

Существуют определенные последовательности нуклеотидов длиной в несколько сотен пар оснований, которые обладают способностью подавлять позитивное и негативное влияние эухроматина и гетерохроматина на экспрессию трансгенов, интегрированных в этот хроматин и фланкированных указанными последовательностями в новом сайте интеграции. Такие участки ДНК как бы изолируют ген, находящийся между ними, способствуя сохранению его обычной пространственной структуры. Эти последовательности и получили название инсуляторов, или регуляторных областей локусов (LCR - locus control regions) . К пограничным последовательностям относятся A-элементы, фланкирующие ген лизоцима цыплят, scs-элементы (specialized chromatin structure elements) , окружающие ген hsp70 Drosophila melanogaster , а также последовательности нуклеотидов, разделяющие регуляторные элементы iab комплекса Bithorax того же объекта. Введение одного из таких элементов между энхансером и промотором регулируемого гена приводит к функциональной изоляции энхансера и подавлению экспрессии гена, а фланкирование гена пограничными последовательностями предохраняет его от инактивирующего действия окружающего конденсированного гетерохроматина, т.е. снимает эффект положения. У высших эукариот энхансер может активировать промотор на расстоянии, достигающем нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов, что является одной из особенностей регуляции транскрипции высших эукариот. 

Внедряясь между энхансером и промотором и блокируя способность энхансера активировать транскрипцию с данного промотора, инсулятор действует, как нейтральный, т.е. не участвующий в активации или репрессии транскрипции, элемент, предотвращающий распространение как позитивной, так и негативной информации от энхансера.  

Инсуляторы не влияют непосредственно на активность энхансера и промотора, т.е. промотор может быть активирован любым другим энхансером, а энхансер может активировать любой другой промотор [10]. Первые два инсулятора дрозофилы, scs и scs' , которые окружают ген теплового шока hsp70 дрозофилы были открыты в 1991 г [9]. Почти одновременно в регуляторной области ретротранспозона дрозофилы МДГ4 был обнаружен su(Нw)-инсулятор [8]. В дальнейшем у курицы был описан еще один инсулятор, который ограничивает глобиновые гены [7]. Интересно, что он работает и в дрозофиле. Существуют данные, что scs-инсулятор дрозофилы может функционировать в клетках мыши и ооцитах морского ежа. Таким образом, инсуляторы из разных организмов должны иметь общие механизмы действия.

При подавлении активности энхансеров инсуляторами проявляется полярность их действия. Инсуляторы однонаправленно выключают энхансеры, расположенные дистально (на значительном расстоянии) по отношении к регулируемому промотору, но не рядом с ним. Показано, что инсуляторы могут разделять два участка хроматина, резко различающиеся по пространственной структуре. В этом случае по одной стороне от пограничной последовательности располагается сильно компактизованный хроматин, ДНК которого недоступна действию нуклеаз, а по другой - хроматин в открытой конформации, характерной для компетентных в отношении транскрипции генов.

Большая часть существующих экспериментальных данных согласуется с тем, что белки, связанные с энхансером, непосредственно взаимодействуют с белками основного транскрипционного комплекса или вспомогательными белками, собранными на промоторе, при этом ДНК между ними образует петлю. Возникает вопрос, каким образом энхансер может взаимодействовать с промотором на больших дистанциях и при этом правильно узнавать свой промотор.

Хотя к настоящему моменту описано огромное количество энхансеров и промоторов, изучено множество факторов транскрипции, вопрос о механизме взаимодействия между энхансером и промотором остается открытым. В понимании механизмов дальних взаимодействий между регуляторными элементами большую роль могут сыграть инсуляторы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ДНК заложена биологическая информация, составляющая программу развития клетки организма.

Основная биологическая функция ДНК заключается в хранении, постоянном самовозобновлении, самовоспроизведении и передаче генетической информации в клетке.

Активация структурных генов происходит с помощью гена – регулятора и гена – оператора. В обычных условиях ген – регулятор активен и синтезирует белки – регуляторы. Если белок – регулятор взаимодействует с оператором, занимающим часть промотора при этом  РНК- полимераза не может соединиться с промотором, транскрипция не идёт.  Такой белок называется репрессором, контроль экспрессии генов – негативным.  Если область оператора расположена перед промотором, связывание РНК-полимеразы с промотором облегчается белком —  регулятором  и оператор запускает транскрипцию со структурных генов. Такие белки называются активаторами, контроль экспрессии генов – позитивным.

Механизмы регуляции были изучены у микроорганизмов французскими учеными Ф. Жакоб и Ж. Моно в 1961 г. Они предложили оперонную модель регуляции транскрипции прокариот. Оперон – это блок тесно связанных структурных и функциональных генов (промотор, оператор, терминатор). Последовательность структурных генов определяет синтез группы белков, учавствующих в одной цепи биохимических реакций. Оперонная модель предполагает наличие единой системы регуляции, то есть объединенные в один оперон структурные гены имеют один общий ген – промотор, ген – оператор и ген – терминатор. Со структурных генов транскрибируется единая полицистронная мРНК, затем она разрезается и синтезируются отельные пептиды. Регуляция транскрипции изучена на кишечной палочке, она может идти по типу индукции и корепрессии.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Биохимия: Учеб. для вузов, Под ред. Е.С. Северина., 2003. 779 с.

2. http://www.biotechnolog.ru/ Биотехнология / Раздел «Генная инженерия» / Введение гена в клетку / Селективные и репортерные гены.

3. Li W., Notani D., Rosenfeld M. G. Enhancers as non-coding RNA transcription units: recent insights and future perspectives. (англ.) // Nature reviews. Genetics. — 2016. — Vol. 17, no. 4. — P. 207—223.

4. Wenbo Li, Dimple Notani & Michael G. Rosenfeld (2016). Enhancers as non-coding RNA transcription units: recent insights and future perspectives. Nature Review Genetics.

5. Andersson, R. et al.(2014). An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature 507, 455–461.

6. Cheng, J. H., Pan, D. Z., Tsai, Z. T. & Tsai, H. K.(2015). Genome-wide analysis of enhancer RNA in gene regulation across 12 mouse tissues. Sci. Rep. 5, 12648.

7. Chung J.Н., Whitely М., Felsenfeld G.A. 5' element of thе chicken b-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila // Се11. 1993. V. 74. Р. 505-514.

8. Geyer Р.K., Corces V.G. DNA position-specific repression of transcription by а Drosophila zinc finger ргоtein // Genes Dev. 1992. V. 6. Р. 1865-1873.

9. Kellum R., Schedl P. А group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer- bloking assay // Мо1. Се1. Вiol. 1992. V. 12. Р. 2424-2431.

10. Scott K.S., Geyer Р.K. Effects of тhе su(Нw) insulator protein on the expression of thе divergently transcribed Drosophila yolk protein genes // ЕМВО J. 1995. V. 14. Р. 6258-6279.