Введение гена в плазмиду E. coli и клонирование рекомбинантной ДНК в клетках
Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК
•ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);
•ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);
•ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);
•ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК.
Введение рекомбинантной ДНК в организм-реципиент
Особенности компетентных клеток:
•1. Внутриклеточные нуклеазы не разрушают включаемую ДНК или РНК.
•2. Вектор способен реплицироваться в пермиссивной клетке.
•3. Выраженная активность промотора и/или терминатора транскрипции рДНК.
•4. Сплайсинг РНК.
•5. Наблюдается эффективная трансляция мРНК.
•6. Нет выраженной активности пептидогидролаз, катализирующих гидролиз экспрессируемых чужеродных белков.
Для включения рДНК в клетки пользуются методами трансформации,
инфекции, микроинъекций, электропорации. Ввод рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина называется трансформацией
обрабатывают клетки бактерий полиэтиленгликолем или хлористым кальцием на холоду (компетентность клеток)
Электропорация
25 мкФ = 2500 В при 200 Ω за 5 мс
Импульсы
высокого
напряжения
обратимо
увеличивают
проницаемость
мембран. На клетку действуют
высоковольтным
импульсом.
Через
образующиеся на короткое время поры ДНК проникает в клетку.
Бомбардировка (баллистическая трансформация)
1)ДНК с целевыми генами, адсорбируется на поверхности микрочастиц (0,6-6 мкм) из инертных металлов - золота или вольфрама.
2)Частицам сообщается кинетическая энергия,
достаточная для прохождения через клеточные стенки.
3) Оказавшись внутри клетки, ДНК с поверхности частиц освобождается в цитоплазму и, если оказывается в ядре, встраивается в ядерный геном.
Микроинъекции
•Механическое введение ДНК в ядра культивируемых клеток млекопитающих, растений.
•Игла стеклянная диаметром 0,1 мкм
Ооциты лягушки
Преимущества и недостатки Esherichia coli в качестве системы экспрессии эукариотических генов
•Преимущества:
•Быстрый рост (6-12 часов от посева до окончания индукции)
•Относительно высокий выход целевого белка (100- 2000 мг/л)
•Низкая цена ростовой среды (натуральные простые компоненты)
•Низкая стоимость ферментации
•Возможность получать микрокристаллы целевого белка (тельца включения)
Недостатки:
Затруднен биосинтез крупных полипептидов (>50 кДа)
Нет системы гликозилирования Ограниченные возможности секреции белков Многие гетерологичные белки токсичны для клеток
Затруднено образование дисульфидных связей (важно для восстановления третичной структуры белка)
Многие гетерологичные белки образуют только тельца включения Отсутствие сплайсинга РНК
Идентификация и отбор клеток, которые приобрели нужный ген
Отбор клонов
Перенос клеток со среды с ампициллином на среду с тетрациклином методом перепечатки
Бактериофаг в качестве вектора
Строение бактериофага
(умеренного фага E.coli К-12)
Схема клонирования ДНК
48500 п.н.
ДНК упакована в головку в виде линейной молекулы с 1 нитевыми комплементарными концами (cos-сайты - липкие концы).
После проникновения в клетку липкие концы взаимно спариваются, молекула замыкается в кольцо и сшивается лигазой.
Клонируют 15 тыс.п.н.
КОСМИДЫ
•Плазмиды,содержащие липкие концы ДНК (cos- участки) фага лямбда. М.б. введены в клетку путем обычной инфекции.
•Клонируют фрагменты ДНК размером 33-39 тыс. п.н.
Наличие cos-сайтов в ДНК является единственным необходимым условием упаковываемости ДНК в фаговые частицы. После адсорбции химерной фаговой частицы на поверхности бактериальной клетки заключенная в ней ДНК проникает (вводится фаговой частицей) внутрь бактерии и начинает автономно реплицироваться как плазмида, размер которой составляет 30-40 т.п.о.