Лабораторна робота № 7 Молочнокисле бродіння. Окислення мікроорганізмами органічних сполук

Перетворення цукру молочнокислими бактеріями до (переважно) молочної кислоти дістало назву молочнокислого бродіння. Збудники цього процесу — молочнокислі бактерії — дуже поширені в природі, їх можна знайти скрізь: у повітрі, воді, грунті, на поверхні овочів, фруктів і, насамперед, у молоці, кишечнику людини і тварин тощо.

Молочнокислі бактерії мають кулясту і паличкоподібну форми, не утворюють спор, нерухливі, грампозитивні. За характером бродіння їх поділяють на дві групи: гомоферментативні, що утворюють при зброджуванні як основний продукт молочну кислоту, і гетероферментативні, які крім молочної кислоти утворюють низку інших продуктів: оцтову і янтарну кислоти, спирт, СО₂ тощо. Сумарне рівняння гомоферментативного бродіння має такий вигляд:

С₆Н₁₂0₆→2СН₃СН(ОН)СООН.

Загальну схему гетероферментативного молочнокислого бродіння можна подати таким сумарним рівнянням:

2С₆Н_І2О₆ → CН₃CH(OH)COOH+НООССН₂СН₂СООН+СН₃СООН+С₂Н₅ОН+СО₂+ Н₂.

Молочнокисле бродіння є основою таких важливих виробництв, як переробка молока на кисломолочні продукти, сир і масло, випікання кислого чорного хліба, квашення овочів, силосування кормів, виготовлення деяких сортів ковбас тощо.

Матеріали та обладнання: 1) молочнокислі продукти; 2) огірковий розсіл; 3) 5 % розчин КМn0₄; 4) H₂SO₄; 5) аміачний розчин AgNO₃; 6) 1 %-й розчин фенолу; 7) РеС1₃; 8) фільтрувальний папір; 9) мікроскопи; 10) предметні та накривні скельця; 11) спиртівки; 12) бритви; 13) скальпелі; 14) препарувальні голки; 15) фіксовані у формаліні або свіжі корені з бульбочками різних бобових рослин; 16) розчин фуксину.

Проведення роботи. Для вивчення молочнокислого бродіння найкраще використовувати молоко, молочнокислі продукти і огірковий або капустяний розсіл. Щоб провести дослід з молоком треба спочатку визначити його вихідну кислотність. Для цього в конічну колбочку об'ємом 50—100 мл наливають 10 мл молока, додають 20 мл дистильованої води і титрують 0,1 н розчином NaOH у присутності індикатора фенолфталеїну до появи світло-жовтого забарвлення. Кислотність визначають у градусах Тернера (умовна величина, яка відповідає кількості мл 0,1 н NaOH, витраченого на нейтралізацію 100 мл молока).

Приклад. На титрування 10 мл молока пішло 4 мл 0,1 н розчину NaOH. У цьому випадку вихідна кислотність молока в градусах Тернера становитиме

4 мл NaOH—10 мл молока,

х мл NaOH —100 мл молока,

х=4·100:10=40° Тернера.

Після визначення кислотності, молоко розливають по 50 мл у конічні колби об'ємом 100 мл. У кількох колбах молоко кип'ятять, а в інших залишають некип'яченим. Колби закривають ватою і ставлять у термостат при температурі ЗО °С на 24 год. За цей час у некип'яченому молоці розвиваються молочнокислі бактерії і утворюється молочна кислота, яка реагує з казеїнатом кальцію, внаслідок чого казеїн випадає в осад.

У кип'яченому молоці бродіння не відбувається, тому що внаслідок кип'ячіння молочнокислі бактерії вбиті, а залишилися тільки спори маслянокислих бактерій, що витримали температуру кипіння. За час інкубації ці спори проростають, відбувається маслянокисле бродіння і утворюється масляна кислота. Остання також реагує з казеїнатом кальцію, в результаті чого випадає казеїнова кислота, .що піддається процесу пептонізації з утворенням неприємного запаху масляної кислоти.

Для мікроскопічного вивчення молочнокислих бактерій виготовляють препарати з кислого молока. На стерильне предметне скло бактеріологічною петлею в краплину дистильованої води наносять молочну сироватку. Виготовлений мазок висушують і фіксують сумішшю спирту з ефіром (1:1). Цю суміш доцільно наносити кілька разів і витримувати протягом 1 хв. При такій фіксації не тільки вбиваються і прикріплюються до скла бактерії, але й водночас, що дуже важливо, видаляється жир, який заважає мікроскопуванню бактерій. Потім препарат фарбують метиленовим синім або карболовим фуксином протягом 2—3 хв, промивають дистильованою водою, висушують і вивчають під мікроскопом з імерсійною системою.

На препаратах добре виявляються молочні стрептококи Streptococcus lactis, довгі паличкоподібні бактерії Lactobacillus bulgaricus, L. acidophilus. Якщо препарат виготовлений з плівки, що утворилася на поверхні молока або огіркового розсолу, то на ньому добре видно великі клітини молочної цвілі Oidium lactis (рис. 7.1).

Рис. 7.1. Збудники молочнокислого бродіння: А — молочний стрептокок (Streptococcus lactis); Б — болгарська паличка (Lastobacillus bulgaricus); В — ооспора молочна цвіль (Oidium lactis)

Присутність молочної кислоти виявляють за допомогою реакції з тіофеном. Для цього вносять у пробірку 2 мл фільтрату молочнокислого продукту, додають 5 мл концентрованої сірчаної кислоти і 0,5 мл насиченого розчину сульфату міді. Суміш збовтують і нагрівають на водяній бані 5 хв при температурі 100 °С. Після цього суміш охолоджують і додають кілька крапель 0,2 %-го спиртового розчину тіофену. При наявності у фільтраті молочної кислоти виникає вишнево-червоне забарвлення.

Запитання до лабораторної роботи 7

1. Молочнокисле бродіння. Бактерії, які викликають молочнокисле бродіння.

2. Гомо- і гетероферментативне молочнокисле бродіння, їх хімізм.

3. Механізм молочнокислого бродіння.

4. Як виявляють присутність молочної кислоти?