27. Получение музеев микроорганизмов.

Производственные культуры хранятся в специальных лабораторных коллекциях и носят название музей микроорганизмов.

Для проведения качественного биотехнологического процесса необходимо поддерживать чистую культуру продуцента. В зависимости от его физиологических свойств и способности сохранять полезные производственные свойства в музейных коллекциях используют:

- периодические пересевы (от 1 раза в две недели, до 1 раза в полгода) на твердых или полутвердых (полужидких) средах;

- хранение в полужидком агаре под маслом (например, вазелиновым), которое позволяет делать пересевы в 2-3 года;

-спорообразующие объекты (дрожжи, бациллы) можно хранить в запаянных ампулах;

- лиофильно высушенные культуры неспорообразующих клеток;

- культуры, замороженные в жидком азоте.

При любом способе хранение необходимо проводить периодическую проверку музейных культур на сохранение ими продуцирующей активности.

Для роста биообъекта, выбранного в качестве продуцента для синтеза определенных целевых продуктов нужны: исходный жизнеспособный посевной материал; источники энергии и углерода; питательные вещества для синтеза биомассы; отсутствие факторов, ингибирующих его рост; соответствующие физико-химические условия (рН, температура, аэрация и другие)

28. Периодическое культивирование микроорганизмов.

Периодическое культивирование микроорганизмов – метод культивирования микроорганизмов, характеризующийся однократным засевом среды в начале и одноразовым получением биомассы в конце процесса, обычно после полного использования субстрата.

Периодическое культивирование микроорганизмов может быть представлено статическими, динамическими и продленными способами культивирования. Статические процессы осуществляются в стационарных условиях без перемешивания. При этом аэробные микроорганизмы обычно развиваются на поверхности жидкой или твердой среды (поверхностное культивирование), например, поверхностный способ жидкофазного культивирования Aspergillus niger для получения лимонной кислоты.

Периодические динамические процессы осуществляются с помощью перемешивания и аэрации: в жидких средах на качалках, в биореакторах при помощи мешалки и барботера.

Сущность периодического способа заключается в том, что весь объем питательной среды загружают в аппарат сразу, добавляют культуру микроорганизмов и при оптимальных условиях ведут процесс до тех пор, пока не накопится нужное количество биомассы или продуктов жизнедеятельности микроорганизмов - метаболитов. При периодическом культивировании изменяется:

• состав среды (уменьшается концентрация питательных веществ и увеличивается количество метаболитов);

• скорость роста;

• морфологические и физиологические свойства культуры.

К тому же возникают технологические трудности - циклический ход операций, сменные технологические режимы, что затрудняет контроль и автоматизацию процесса. Эффективность данного способа низкая (70 % времени приходится на непроизводительные стадии - лаг-фазу и фазу отмирания).

Развитие происходит в виде последовательных фаз, характер и продолжительность которых зависят от физиологического состояния клеток, определяемого в свою очередь условиями разнообразных факторов среды, в которой развиваются популяция того или иного организма. Другими словами, фазы роста микроорганизма отражают количественные и качественные изменения в их биомассе и окружающей среде.

Исходная фаза (лаг-фаза или индукционный период) является фазой задержки роста, когда размножения микробных клеток не происходит. Эта фаза характеризуется отсутствием роста клеток. В этот период посевная культура приспосабливается к изменившимся внешним условиям и вырабатывает ферменты, необходимые для роста на данной питательной среде. Продолжительность лаг-фазы зависит от состава питательной среды, от качества посевного материала хранения, от посевной дозы.

Фаза экспоненциального (показательного) роста. Она характеризуется постоянной и максимальной скоростью роста клеток. Рост микробов в эту фазу происходит в геометрической прогрессии. Продолжительность этой фазы зависит от запаса питательных веществ в среде, от условий аэрации, от перемешивания и др. факторов. Для описания процессов роста микроорганизмов используют такие характеристики, как общая и удельная скорости роста биомассы (или числа клеток). Другой важной характеристикой роста культуры является время генерации, за которое биомасса культуры удваивается. Время генерации из разных культур микроорганизмов сильно различается.

Фаза замедления роста. В эту фазу скорость размножения замедляется, а время генерации увеличивается. Наступление этой фазы обусловлено истощением питательной среды и накоплением в культуральной жидкости токсических веществ, которые начинают ингибировать развитие культуры. Кроме того, в эту фазу происходит наивысшее накопление микробной массы в единице объёма.

Стационарная фаза роста, или максимума, на протяжении которой численность микробной популяции не уменьшается. В эту фазу скорость размножения и отмирания клеток одинаковая. Концентрация живых клеток в эту фазу достигает максимума, и она называется М-концентрацией. В этой фазе сама биомасса микроорганизмов и продукты их биосинтеза обладают наибольшей биотехнологической ценностью.

Фаза отмирания микробной популяции. Любая микробная популяция, растущая в сосуде с несменяемой средой, вступает после фазы стационарного роста в стадию отмирания. По скорости отмирания вначале устанавливают фазу ускоренного отмирания (VI), затем фазу постоянной скорости отмирания (VII) и фазу замедленной скорости отмирания (VIII). Причинами отмирания микробной популяции являются истощение среды и накопление в ней большого количества токсических продуктов метаболизма. В период стадии отмирания общее количество биомассы уменьшается.