Проточная цитометрия

- метод количественного анализа клеток в потоке несущей жидкости с

использованием проточных цитометров.

Основные принципы метода:

1. из ткани получают клеточную суспензию, состоящую из отдельных

клеток

2. клетки обрабатывают веществами, количественно связывающимися с

определенными клеточными структурами:

1. антитела – на белки в клеточной поверхности

2. ДНК-зонды

3. РНК-зонды и т.д.

3. использование флуоресцентной метки, присоединяемой к получаемому

комплексу

4. выстраивание клеток в потоке жидкости в один ряд, в одну линию

5. возбуждение флуоресцентных меток на клетках энергией лазера

6. измерение интенсивности люминесценции метки ФЭУ

7. обработка полученных результатов на ЭВМ

8. результаты исследований представлены в виде гистограмм распреде-

ления и вариационных рядов цифровых значений

Варианты:

1. количественная гистохимия

• измерение количества веществ в клетке с помощью

проведения химических реакций

- пример – ДНК-цитометрия

2. Иммунофенотипирование

- выявление комплекса антиген-антитело

ДНК-цитометрия

- изучение количества ДНК в ядрах клеток

Задачи:

1. оценка уровня активности пролиферативных процессов в ткани

2. распределение ядер клеток по плоидности

3. определение временных параметров клеточного цикла

4. выявление состояний анэуплоидии – отличающегося от нормального содержание ДНК

Окраска:

Люминесцентный краситель в реакции по Фельгену

Результаты исследования:

В виде ДНК-гистограмм - распределение изучаемых клеток по содержанию в их ядрах ДНК.

Три группы клеток:

1. диплоидные - содержание ДНК - 2с (хромосом – 2n)

2. промежуточные - 2с-4с

3. тетраплоидные - 4с

Т.о., клетки с определенным содержанием ДНК распределяются по периодам клеточного цикла следующим образом:

2с - характеризуют количество клеток в Go и G1 периодах

2с-4с - количество клеток в синтетическом периоде

4с - количество клеток в G2 и М-периодах цикла

Расчет величины пролиферативного пула клеток:

Клетки:

1. синтетическом,

2. премитотическом

3. митотическом периодах цикла

- чем выше его величина – тем выше скорость обновления ткани

наименьшая (стремиться к нулю) - в нейронах

наибольшая - гемопоэтическая и эпителий слизистой

пищеварительной трубки (до 50%)

Временные параметры митотического цикла:

- время прохждения периодов цикла

G1 – период - 3-10 часов

S - период - 7-10 часов

G2 – период - 2-3 часа

М- период - около 1 часа

Gо – период

А. всю клеточную жизнь - нейроны

Б. несколько часов - стволовые клетки

Иммунофенотипирование

- метод качественного и количественного определения наличия

исследуемых антигенов в клетках

Задачи:

1. изучение наличия на поверхности или внутри клеток рецепторных белков - антигенов

2. определение количества клеток, имеющих (экспрессирующих)

этот рецептор в исследуемой популяции

3. определение количества рецепторов на поверхности клеток

4. определение сочетания нескольких рецепторов на поверхности одной клетки (коэкспрессия)

Окраска:

Моноклональные антитела, меченные люминесцентной меткой

Моноклональные антитела позволяют выявлять дифференцировочные антигены на гемопоэтических клетках крови у человека и имеют маркировку CD (cluster of differentiation) - кластер дифференцировки:

Практическое использование:

1. исследование клеточного иммунитета

2. оценка гемопоэза

Исследование клеточного звена иммунитета у человека:

CD3 - Т-лимфоциты - норма в крови взрослого - 67-76%

CD3,CD4 - Т-хелперы - 38-46%

CD3,CD8 - Т-супрессоры - 31-40%

Соотношение хелперы/супрессоры - 1-1,5

(при СПИДе – соотношение снижается меньше 1)

CD19 - В-лимфоциты - норма - 11-16 %

CD16 - макрофаги

CD38 - плазмоциты

2. оценка гемопоэза:

• 1-4 классы зрелости – морфологически нераспознаваемые

• распознавание – иммунологическое – иммунофенотипирование

• суть метода

- часть рецепторных белков сохраняются в клетке всегда, они характеризуют тип кроветворения – лимфоидное, миелоидное и линию – Т- и В- лимфоциты

– при созревании клеток одни рецепторные белки на поверхности появляются, а другие исчезают